Der Einsatz von Gas-Chromatographie zu Änderungen der Zusammensetzung der Fettsäuren in Rattenlebergewebe während der Schwangerschaft Analysieren
Summary
Schwangerschaft führt zu signifikanten Änderungen der Fettsäurezusammensetzung von mütterlichem Gewebe. Lipid-Profile können über Gaschromatographie erhalten werden, damit die Identifizierung und Quantifizierung von Fettsäuren in den einzelnen Lipidklassen unter Ratten während der Schwangerschaft zugeführt verschiedenen Hoch-und fettarme Ernährung.
Abstract
Gaschromatographie (GC) ist ein auf Basis von Geweben, Zellen und Plasma / Serum zu identifizieren und die Fettsäuren der Lipide, wodurch Ergebnisse mit hoher Genauigkeit und hoher Reproduzierbarkeit hochempfindliche Methode. Im Stoffwechsel-und Ernährungsstudien ermöglicht GC Beurteilung von Änderungen der Fettsäure-Konzentrationen nach Eingriffen oder bei Veränderungen in physiologischen Zustand wie Schwangerschaft. Festphasenextraktion (SPE) mit Aminopropyl-Silicakartuschen ermöglicht die Trennung der Hauptlipidklassen, einschließlich Triglyceride, verschiedene Phospholipide, und Cholesterylester (CE). GC in Kombination mit SPE wurde verwendet, um die Änderungen in der Fettsäurezusammensetzung der CE-Fraktion in der Leber von Jungfrau und trächtige Ratten, die verschiedenen Hoch-und fettarme Ernährung zugeführt hatte zu analysieren. Es gibt signifikante Diät / Schwangerschaft Wechselwirkungen auf die Omega-3 und Omega-6-Fettsäuren von Leber CE, das anzeigt, dass schwangere Frauen eine unterschiedliche Reaktion auf Nahrungs MANIPULATIonen, als unter den jungfräulichen Weibchen gesehen.
Introduction
Gaschromatographie (GC) ist eine gut etablierte Technik, die zur Nahrungsergänzung bei oder physiologischen Bedingungen, wie Fettsucht (und verwandten Krankheiten wie Diabetes) oder Schwangerschaft 3 in Lipidpools und Zellmembranen 1,2 Identifizierung und Quantifizierung des Einbaus von Fettsäuren – 5. Es ist auch für die Analyse der Art und Menge der Fette in Lebensmitteln. Dies ist nützlich bei der Charakterisierung von Versuchsdiäten, sowie die Gewährleistung, dass die Lebensmittelindustrie erfüllt die Norm. Zum Beispiel kann GC verwendet werden, um die Identität und Menge der Fettsäuren in einem Produkt, wie ein Nahrungsergänzungsmittel zu bestätigen, um sicherzustellen, dass die Kennzeichnung korrekt und Vorschriften eingehalten 6,7. Analyse der Fettsäuren können wertvolle Einblicke in den Fettstoffwechsel in Gesundheit und Krankheit, die Auswirkungen der Änderung der Ernährungsgewohnheiten und die Auswirkungen von Änderungen in physiologischen Zustand 8 bereitzustellen. Verwendung von GC-Proben während der Schwangerschaft Studie hat wichtige bereitgestelltInformationen über Änderungen in Fettsäure und komplexe Lipidhomöostase 3.
Vor der chromatographischen Trennung, Lipide werden typischerweise aus der Probe unter Verwendung der Löslichkeit der Lipide im Lösungsmittel Mischungen aus Chloroform und Methanol extrahiert. Natriumchlorid wird zugegeben, um die Trennung der Mischung in eine wässrige und organische Phasen enthaltendes Lipid 9,10 erleichtern. Komplexe Lipidklassen von Interesse aus der Gesamtlipidextrakt durch Festphasenextraktion (SPE) getrennt werden. Dieses Trennverfahren eluiert Lipidklassen auf der Grundlage ihrer Polarität oder Bindungsaffinität. Triacyglycerols (TAG) und Cholesterinester (CE) zunächst als Kombinationsanteil, weitere Klassen, Phosphatidylcholin (PC) eluiert, Phosphatidylethanolamin (PE), und nicht-veresterten Fettsäuren (NEFA), indem die Polarität der Elutionsmittel eluiert . Die Trennung der TAG von CE nutzt die Bindung von TAG nur zu einem frischen SPE cartridge, so dass CE eluiert werden. TAG kann dann durch Erhöhen der Polarität des Lösungsmittels 9,10 Elution eluiert werden. Diese Verfahren können mehrere Proben gleichzeitig mit einer höheren Ausbeute als getrennt werden mit Dünnschichtchromatographie erreicht, was bedeutet, dass relativ klein Proben (z. B. <100 ul Plasma oder Serum, <100 mg Gewebe) können analysiert werden 11,12.
GC ist eine gut etablierte Technik zuerst in den 1950er Jahren beschrieben, wurde vorgeschlagen, dass die mobile Phase in der dann Flüssigkeit-Flüssigkeit-Systeme können mit Dampf ersetzt werden. Es wurde ursprünglich für die Erdöl-Analyse verwendet, aber schnell in anderen Bereichen, wie Aminosäureanalyse und Lipidbiochemie, die immer noch von besonderem Interesse erweitert. Fortschritte in der GC und Technologie wie die Entwicklung von Kapillarsäulen von den bisher verwendeten Füllkörper hat unseren derzeitigen Techniken, bei denen Fettsäuren sind in der Lage zu sein, führteeffizienter bei niedrigeren Temperaturen, was zu GC routinemäßig verwendet werden, um in einer Vielzahl von Untersuchungen 13 identifizieren und zu quantifizieren Fettsäuren getrennt.
GC benötigt Fettsäuren zu, damit sie ausreichend flüchtig, um bei vernünftigen Temperaturen ohne thermische Zersetzung eluiert werden können derivatisiert werden. Dies beinhaltet gewöhnlich die Substitution einer funktionellen Gruppe Wasserstoff enthaltenden Ester, Thioester oder Amide, zur Analyse zu bilden. Methylester sind häufig Derivate untersucht, die durch Methylierung hergestellt werden. In diesem Verfahren werden die Esterbindungen in komplexen Lipiden hydrolysiert, um freie Fettsäuren, die transmethyliert zu Fettsäuremethylester (FAME) bilden freizugeben. Das resultierende Profil der FAME GC bestimmt wird, wird als die Fettsäurezusammensetzung bezeichnet und kann leicht zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen 9,10 verglichen werden. Die Technik ermöglicht sowohl die Anteile der einzelmanuelle Fettsäuren und deren Konzentrationen zu messen.
Neben der Verwendung von GC analysiert Fettsäuren in der Ernährung Studien und in der Lebensmittelindustrie, kann die Technik für eine Vielzahl von Analysefeldern verwendet werden. Zum Beispiel, Umweltanalysen mit GC sind die Bestimmung von Wasserverunreinigungen durch Insektizide und Bodenanalysen Messchlorgehalt. In der Toxikologie hat GC auch verwendet, um illegale Substanzen in Urin-und Blutproben von Personen zu identifizieren, wie ein Sport-Leistungsförderer 12 und die Fähigkeit, komplexe Mischungen von Kohlenwasserstoffen zu trennen macht diese Technik beliebt in der Erdölindustrie für petrochemische Analyse 12.
Schwangerschaft mit signifikanten Änderungen der Fettsäurezusammensetzung von mütterlichem Gewebe, insbesondere des Gehalts an Omega-3 (n-3) und Omega-6 (n-6) polyungesättigten Fettsäuren aci zugehörigends (PUFA) 3. In der aktuellen Studie, veranschaulichen wir die Verwendung von GC in der Messung der Fettsäuren durch die Beschreibung seiner Verwendung in der Analyse der Fettsäurezusammensetzung von Lebergewebe aus Jungfrau und trächtige Ratten Fett niedrigen und hohen Diäten mit verschiedenen Ölquellen gespeist übernommen. Die experimentellen Diäten hier vorgesehen waren eine fettarme Sojaölbasis Diät, eine fettreiche Sojaöl-Diät (130,9 g Gesamtfett / kg Gesamtfett) oder eine hohe Fett-Leinöl-Diät (130,9 g Gesamtfett / kg Ernährung) für 20 Tage zur Verfügung gestellt. Der vollständige Nährstoff und Fettsäurezusammensetzung dieser Diäten wurden zuvor 14 beschrieben. Die Sojaöl-Diäten sind reich an Linolsäure (18.02 n-6) und enthalten eine α-Linolensäure (n-3-18.03 Uhr), während der Leinöl-Diät ist reich an α-Linolensäure. Diese fettreiche Ernährung repräsentieren unterschiedliche Rationen von Linolsäure zu α-Linolensäure (Ration von 8:1 und 1:1, jeweils). Das Verfahren zur Isolierung einzelner Lipidklassen und Analyse durch GC ist, dass wirll entwickelt und validiert, und hat vorher 10, aber ohne detaillierte technische Beschreibung hier gefunden veröffentlicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gas-Chromatographie ist eine genaue Technik, um für die Fettsäureanalyse zu verwenden, und die hohe Reproduzierbarkeit hält diese Technik für die klinische Analysen. Falls GC-Säulen verwendet werden, um die Identifizierung der Fettsäuren von Interesse zu ermöglichen, die verfügbaren Spalten mit Variationen in der Polarität der stationären Phase, Säulenlänge und Innendurchmesser. Die Verwendung einer Quarzglas-Kapillarsäule in dieser Analysemethode eine gute thermische Stabilität und eine hohe Reproduzierba…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten den Beitrag von Meritxell Romeu-Nadal in die Studie an Ratten bestätigen.
Materials
| Methanol: | Fisher Scientific | M/4056/17 | 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade |
| Chloroform: | Fisher Scientific | C/4966/17 | 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade |
| BHT: | Sigma- Aldrich | W218405 | 'CAUTION' Dust fumes – Anhydrous |
| NaCl | Sigma- Aldrich | S9888 | Anhydrous |
| Hexane | Fisher Scientific | H/0406/17 | 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade |
| Glacial acetic acid | Sigma- Aldrich | 695084 | 'CAUTION' Burns – 99.85% |
| Sulfuric acid | Sigma- Aldrich | 339741 | 'CAUTION' Burns – 99.999% |
| Potassium carbonate | Sigma- Aldrich | 209619 | 99% ACS Reagent grade |
| Potassium bicarbonate | Sigma- Aldrich | 237205 | 99.7% ACS Reasgent grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10204340 | 'CAUTION' Fumes – 99+% GLC SpeciFied |
| Toluene | Fisher Scientific | T/2300/15 | 'CAUTION' Fumes |
| Diethyl ether | Sigma- Aldrich | 309966 | 'CAUTION' Fumes |
| Nitrogen (oxygen free) cylinder | BOC | 44-w | 'CAUTION' Compressed gas – explosion risk |
| Aminopropyl silica SPE cartridges | Agilent | 12102014 | Cartridge – Bead mass 100mg |
| Silica gel SPE cartidges | Agilent | 14102010 | Cartridge – Bead mass 100mg |
| Molecular seives | Sigma- Aldrich | 334324 | Pellets, AW-300, 1.6mm |
| Glass pasteur pipettes | Fisher Scientific | FB50251 | |
| Borosilicate glass test tube | Fisher Scientific | FB59527 | Non-screw cap |
| Screw thread glass test tubes | Fisher Scientific | FB59555 | 13mm |
| Caps for screw thread test tubes | Fisher Scientific | FB51353 | To fit 13mm tube |
| Solida phase extraction (SPE) tank | Agilent | VacElut 20 Manifold | |
| Luer stopcocks for SPE tank | Agilent | 12131005 | |
| Vacuum pump | Sigma- Aldrich | 2656-194GB-1EA | |
| GC vials | Kinesis | STV 12-03TS | Short thread 9mm, TPX 0.2ml fused glass insert |
| GC vial lids | Kinesis | SCC09-0.2B | Short thread 9mm blue |
| GC inlet liners | SGE Analytical science | 092002 | Split/splitless Focus liner ID 4mm, OD 6.3mm length 78.5mm |
| GC septa | SGE Analytical science | 041856 | 11mm, MN material |
| GC column | SGE Analytical science | 054612 | Length 30m, ID 0.22mm, Film thickness 0.25µm |
| Gas chromatograph | HP 6890 series |
Riferimenti
- Browning, L. M., et al. Incorporation of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids into lipid pools when given as supplements providing doses equivalent to typical intakes of oily fish. Am. J. Clin. Nutr. 96 (4), 748-758 (2012).
- Cao, J., Schwichtenberg, K. A., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y. Incorporation and clearance of omega-3 fattyacids in erythrocyte membranes and plasma phospholipids. Clin. Chem. 52 (12), 2265-2272 (2006).
- Lauritzen, L., Carlson, S. E. Maternal fatty acid status during pregnancy andlactation and relation to newborn and infant status. Matern. Child Health. 7 (2), 41-58 (2011).
- Kelsall, C. J., et al. Vascular dysfunction induced in offspring by maternal dietary fat involves altered arterial polyunsaturated fatty acid biosynthesis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Karpe, F., Dickmann, J. R., Frayn, K. N. Fatty acids, obesity, and insulin resistance: time for a re-evaluation. Diabetes. 60 (10), 2441-2449 (2011).
- Mossoba, M. M., Moss, J., Kramer, J. K. Trans fat labelling and levels in U.S. foods: assessment of gas chromatographic and infrared spectroscopic techniques for regulatory compliance. J. AOAC Int. 92 (5), 1284-1300 (2009).
- Chee, K. M., et al. Fatty acid content of marine oil capsules. Lipids. 25 (9), 523-528 (1990).
- Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Burdge, G. C., Wright, P., Jones, E. A., Wootton, S. A. A method for separation of phosphatidylcholine, triacylglycerol, non-esterified fatty acids and cholesterol esters from plasma by solid-phase extraction. Br. J. Nutr. 84 (5), 781-787 (2000).
- Seppänen-Laakso, T., Laakso, I., Hiltunen, R. Analysis of fatty acids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition. Anal. Chim. Acta. 465 (1), 39-62 (2002).
- Beesley, T. E., Buglio, B., Scott, R. P. W. . Quantitative chromatographic analysis. , (2000).
- Bartle, K. D., Myers, P. History of gas chromatography. Trends Anal. Chem. 21 (9), 9-10 (2002).
- Childs, C. E. . The effect of gender, pregnancy and diet upon rat tissue fatty acid composition and immune function. , 378 (2008).
- Harris, S. W., Pottala, J. V., Ramachandran, S. V., Larson, M. G., Robins, S. J. Changes in erythrocyte membrane Trans and marine fatty acids between 1999 and 2006 in older Americans. J. Nutr. 142 (7), 1297-1303 (2012).
- Roberts, L. D., McCombie, G., Titman, C. M., Griffin, J. L. A matter of fat: An introduction to lipidomic profiling method. J. Chromatogr. B. 871 (2), 174-181 (2008).
