妊娠中にラット肝組織中の脂肪酸の組成変化を分析するために、ガスクロマトグラフィーの使用
Summary
妊娠は、母体組織の脂肪酸組成に有意な変化をもたらす。脂質プロフィールは、ラットの間で個々の脂質クラス内の脂肪酸の同定および定量は、妊娠中の種々の高および低脂肪食を給餌できるように、ガスクロマトグラフィーを介して得ることができる。
Abstract
ガスクロマトグラフィー（GC）を高精度かつ再現性の高い結果が得られ、組織、細胞、血漿/血清から脂質の脂肪酸含量を同定および定量するために使用される高感度な方法である。代謝および栄養の研究においてGCは、脂肪酸濃度の変化の評価は、介入の後、または妊娠などの生理的状態の変化の間に可能にする。アミノプロピルシリカカートリッジを使用して固相抽出（SPE）は、トリアシルグリセロール、様々なリン脂質、およびコレステリルエステル（CE）を含む主要な脂質クラスの分離を可能にする。 SPEと組み合わさGCは、種々の高および低脂肪食を給餌されたバージン及び妊娠ラットの肝臓におけるCE画分の脂肪酸組成の変化を分析するために使用した。肝臓CEのω-3およびω-6脂肪酸含有量に大きなダイエット/妊娠相互作用効果は、妊娠中の女性が食物manipulatに対して異なる応答を有することを示してありよりイオンは処女雌の間で見られます。
Introduction
ガスクロマトグラフィー（GC）は、肥満症（および糖尿病などの関連疾患）、または妊娠3などの補充または生理学的状態の間脂質プールおよび細胞膜1,2への脂肪酸の取り込みを同定および定量するために使用される十分に確立された技術である– 5。それはまた、食品中の脂肪のタイプおよび量を分析するのに適している。実験食を特徴付けるだけでなく、食品業界は、規制に準拠していることを確実にする場合に便利です。例えば、GC、その標識が正しく、規制が6,7に接着されるように、このような栄養補助食品のような製品内のアイデンティティおよび脂肪酸の量を確認するために使用することができる。脂肪酸の分析では、健康と病気、食事変更の影響、および生理的状態8の変化の影響での脂質代謝への貴重な洞察を提供することができます。妊娠中にサンプルを研究するため、GCの使用が重要に提供してきました脂肪酸と複合脂質の恒常3の変化についての情報。
クロマトグラフィー分離の前に、脂質は、典型的には、クロロホルムとメタノールの溶媒混合物中の脂質の溶解度を用いてサンプルから抽出される。塩化ナトリウム相9,10を含有する水性および有機脂質への混合物の分離を容易にするために添加される。関心対象の複合脂質クラスは、固相抽出（SPE）によって総脂質抽出物から分離することができる。この分離技術は、それらの極性または結合親和性に基づいた脂質クラスを溶出する。 Triacyglycerols（TAG）およびコレステリルエステル（CE）を合わせた画分、さらにクラス、ホスファチジルコリン（PC）として最初に溶出され、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、および非エステル化脂肪酸（NEFA）は、溶出溶媒の極性を増加させることによって溶出される。 CEからのタグの分離は、新鮮なのSPE cartri、タグの結合を利用DGE、CEが溶出することができるようにする。 TAGは、次いで溶出溶媒9,10の極性を増加させることによって溶出させることができる。この方法は、複数のサンプルが比較的小さいサイズのサンプル（ 例えば、<100μlの血漿または血清、<100 mgの組織）は11,12分析することができることを意味する薄層クロマトグラフィーを用いて達成されるよりも高い収率で同時に分離することができる。
GCは、最初、1950に記載された十分に確立された技術であり、これは、次いで、液 – 液系における移動相は蒸気で置き換えることができることが示唆された。当初は石油分析のために使用されるが、そのような急速に主要な関心が依然としてあるアミノ酸分析および脂質生化学などの他の分野に拡大した。以前に使用した充填カラムからこのようなキャピラリカラムの開発など、GC機器や技術の進歩により、脂肪酸があることができるかが私たちの現在の技術につながっているGCは、日常的な調査13の広い範囲で脂肪酸を同定および定量するために使用され、その結果、より低い温度でより効率的に分離する。
GCは、それらが熱分解することなく、妥当な温度で溶出するのに十分に揮発性になることができるようにするために誘導体化される脂肪酸を必要とする。これは、通常、分析のためにエステル、チオエステル、またはアミドを形成するために水素を含む官能基の置換を含む。メチルエステルは一般的にメチル化によって製造される誘導体を、研究されている。この方法では、複合脂質中のエステル結合が脂肪酸メチルエステル（FAME）を形成するtransmethylatedされている遊離脂肪酸を放出するために加水分解される。 GCにより決定FAMEの結果として生じるプロファイルは、脂肪酸組成物と呼ばれ、簡単に異なる実験群9,10の間で比較することができる。技術は個々を、両方の割合ができますUALの脂肪酸およびそれらの濃度を測定する。
栄養学研究において、食品業界内の脂肪酸を分析するためのGCの使用に加えて、この技術は、分析の幅広い分野で使用できる。例えば、GCを用いて、環境分析は殺虫剤および土壌水の汚染を測定することが含まクロロベンゼン含有量を測定解析する。毒物学では、GCはまた、尿、個人の血液試料中の違法な物質を同定するために使用されている等のスポーツパフォーマンスエンハンサー12及び炭化水素の複雑な混合物を分離する能力は、石油化学分析12のための石油産業におけるこの技術が人気となる。
妊娠は、多価不飽和脂肪酸アシ有意な母体組織の脂肪酸組成の変化、具体的にはω-3の含有量が第（n-3）およびω-6（n-6）系に関連付けられているDS（PUFA）3。現在の研究では、異なる油供給源と低および高脂肪食を与えた処女と妊娠ラットから採取した肝臓組織の脂肪酸組成の分析においてその使用を記述することにより脂肪酸の測定におけるGCの使用を例示する。ここで提供される実験食は低脂肪大豆油ベースの食、高脂肪大豆油ベースの食事療法（130.9グラム総脂肪/ kgの総脂肪）または高脂肪亜麻仁油ベースの食事療法（130.9グラム総脂肪/ kgであった20日間のために提供食）、。これらの食事の完全な栄養素と脂肪酸組成は、以前に14に記載されている。大豆油食はリノール酸（18:2 n-6系）に富み、亜麻仁油食は、α-リノレン酸が豊富に含まれている間、いくつかのα-リノレン酸（18:3 n-3系）が含まれている。これらの高脂肪食は、リノールα-リノレン酸にする（それぞれ8:1 1:1の配給）の異なる飼料を表しています。個々の脂質クラスの分離とGCによる分析のための方法は、我々であるLL設立され、検証され、以前に10ではなく、ここに見つかった詳細な技術的説明なしに公開されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ガスクロマトグラフィーは脂肪酸分析のために使用する正確な技術であり、その高い再現性が臨床分析に適したこの技術を認める。適切なGCカラムは、使用可能なカラムは、固定相、カラムの長さと内径の極性の変化を有する、関心対象の脂肪酸の同定を可能にするために使用されなければならない。この分析方法では、溶融シリカキャピラリーカラムの使用は、良好な熱安定性およびその?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ラットの研究にMeritxellロム·ナダルの貢献を感謝したい。
Materials
| Methanol: | Fisher Scientific | M/4056/17 | 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade |
| Chloroform: | Fisher Scientific | C/4966/17 | 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade |
| BHT: | Sigma- Aldrich | W218405 | 'CAUTION' Dust fumes – Anhydrous |
| NaCl | Sigma- Aldrich | S9888 | Anhydrous |
| Hexane | Fisher Scientific | H/0406/17 | 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade |
| Glacial acetic acid | Sigma- Aldrich | 695084 | 'CAUTION' Burns – 99.85% |
| Sulfuric acid | Sigma- Aldrich | 339741 | 'CAUTION' Burns – 99.999% |
| Potassium carbonate | Sigma- Aldrich | 209619 | 99% ACS Reagent grade |
| Potassium bicarbonate | Sigma- Aldrich | 237205 | 99.7% ACS Reasgent grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10204340 | 'CAUTION' Fumes – 99+% GLC SpeciFied |
| Toluene | Fisher Scientific | T/2300/15 | 'CAUTION' Fumes |
| Diethyl ether | Sigma- Aldrich | 309966 | 'CAUTION' Fumes |
| Nitrogen (oxygen free) cylinder | BOC | 44-w | 'CAUTION' Compressed gas – explosion risk |
| Aminopropyl silica SPE cartridges | Agilent | 12102014 | Cartridge – Bead mass 100mg |
| Silica gel SPE cartidges | Agilent | 14102010 | Cartridge – Bead mass 100mg |
| Molecular seives | Sigma- Aldrich | 334324 | Pellets, AW-300, 1.6mm |
| Glass pasteur pipettes | Fisher Scientific | FB50251 | |
| Borosilicate glass test tube | Fisher Scientific | FB59527 | Non-screw cap |
| Screw thread glass test tubes | Fisher Scientific | FB59555 | 13mm |
| Caps for screw thread test tubes | Fisher Scientific | FB51353 | To fit 13mm tube |
| Solida phase extraction (SPE) tank | Agilent | VacElut 20 Manifold | |
| Luer stopcocks for SPE tank | Agilent | 12131005 | |
| Vacuum pump | Sigma- Aldrich | 2656-194GB-1EA | |
| GC vials | Kinesis | STV 12-03TS | Short thread 9mm, TPX 0.2ml fused glass insert |
| GC vial lids | Kinesis | SCC09-0.2B | Short thread 9mm blue |
| GC inlet liners | SGE Analytical science | 092002 | Split/splitless Focus liner ID 4mm, OD 6.3mm length 78.5mm |
| GC septa | SGE Analytical science | 041856 | 11mm, MN material |
| GC column | SGE Analytical science | 054612 | Length 30m, ID 0.22mm, Film thickness 0.25µm |
| Gas chromatograph | HP 6890 series |
Riferimenti
- Browning, L. M., et al. Incorporation of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids into lipid pools when given as supplements providing doses equivalent to typical intakes of oily fish. Am. J. Clin. Nutr. 96 (4), 748-758 (2012).
- Cao, J., Schwichtenberg, K. A., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y. Incorporation and clearance of omega-3 fattyacids in erythrocyte membranes and plasma phospholipids. Clin. Chem. 52 (12), 2265-2272 (2006).
- Lauritzen, L., Carlson, S. E. Maternal fatty acid status during pregnancy andlactation and relation to newborn and infant status. Matern. Child Health. 7 (2), 41-58 (2011).
- Kelsall, C. J., et al. Vascular dysfunction induced in offspring by maternal dietary fat involves altered arterial polyunsaturated fatty acid biosynthesis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Karpe, F., Dickmann, J. R., Frayn, K. N. Fatty acids, obesity, and insulin resistance: time for a re-evaluation. Diabetes. 60 (10), 2441-2449 (2011).
- Mossoba, M. M., Moss, J., Kramer, J. K. Trans fat labelling and levels in U.S. foods: assessment of gas chromatographic and infrared spectroscopic techniques for regulatory compliance. J. AOAC Int. 92 (5), 1284-1300 (2009).
- Chee, K. M., et al. Fatty acid content of marine oil capsules. Lipids. 25 (9), 523-528 (1990).
- Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Burdge, G. C., Wright, P., Jones, E. A., Wootton, S. A. A method for separation of phosphatidylcholine, triacylglycerol, non-esterified fatty acids and cholesterol esters from plasma by solid-phase extraction. Br. J. Nutr. 84 (5), 781-787 (2000).
- Seppänen-Laakso, T., Laakso, I., Hiltunen, R. Analysis of fatty acids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition. Anal. Chim. Acta. 465 (1), 39-62 (2002).
- Beesley, T. E., Buglio, B., Scott, R. P. W. . Quantitative chromatographic analysis. , (2000).
- Bartle, K. D., Myers, P. History of gas chromatography. Trends Anal. Chem. 21 (9), 9-10 (2002).
- Childs, C. E. . The effect of gender, pregnancy and diet upon rat tissue fatty acid composition and immune function. , 378 (2008).
- Harris, S. W., Pottala, J. V., Ramachandran, S. V., Larson, M. G., Robins, S. J. Changes in erythrocyte membrane Trans and marine fatty acids between 1999 and 2006 in older Americans. J. Nutr. 142 (7), 1297-1303 (2012).
- Roberts, L. D., McCombie, G., Titman, C. M., Griffin, J. L. A matter of fat: An introduction to lipidomic profiling method. J. Chromatogr. B. 871 (2), 174-181 (2008).
