O uso de cromatografia gasosa para analisar composicional Alterações de ácidos graxos no tecido de fígado de rato durante a gravidez
Summary
Gravidez leva a mudanças significativas na composição de ácidos graxos dos tecidos maternos. Perfil lipídico pode ser obtido através de cromatografia de gás para permitir a identificação e quantificação de ácidos graxos em classes de lipídios individuais entre ratos alimentados com dietas ricas em gordura vários altos e baixos durante a gravidez.
Abstract
Cromatografia em fase gasosa (GC) é um método altamente sensível para identificar e quantificar o teor de ácidos graxos de lipídios a partir de tecidos, células e plasma / soro, produzindo resultados com alta precisão e alta reprodutibilidade. Em estudos metabólicos e nutricionais GC permite a avaliação de alterações nas concentrações de ácidos graxos seguintes intervenções ou durante mudanças no estado fisiológico, como a gravidez. Extracção em fase sólida (SPE) com aminopropilo cartuchos de sílica permite a separação das principais classes de lípidos incluídos triacilgliceróis, fosfolípidos diferentes, e ésteres de colesterol (CE). GC combinada com SPE foi utilizado para analisar as mudanças na composição de ácidos graxos da fração CE nos fígados de ratos virgens e grávidas que tinham sido alimentados várias dietas de alto e baixo teor de gordura. Há efeitos significativos de interação dieta / gravidez sobre o teor de ácido ômega-3 e ômega-6 ácidos graxos do fígado CE, indicando que as fêmeas grávidas têm uma resposta diferente para Manipulat dietéticoíon que é visto entre as mulheres virgens.
Introduction
Cromatografia em fase gasosa (GC) é uma técnica bem estabelecida utilizada para identificar e quantificar a incorporação de ácidos gordos para piscinas lipídicas e das membranas celulares durante 1,2 ou suplementação condições fisiológicas, tais como a obesidade (e doenças relacionadas tais como diabetes) ou gravidez 3 – 5. Também é adequado para a análise dos tipos e quantidades de gorduras em alimentos. Isto é útil na caracterização dietas experimentais, bem como garantir que a indústria de alimentos está em conformidade com os regulamentos. Por exemplo, GC, pode ser utilizado para confirmar a identidade e a quantidade de ácidos gordos num produto, como um suplemento dietético para assegurar que a rotulagem é correcta e regulamentos são respeitados 6,7. Análise de ácidos graxos podem fornecer informações valiosas sobre o metabolismo lipídico na saúde e na doença, o impacto da mudança na dieta, e os efeitos das mudanças no estado fisiológico 8. A utilização de GC para estudar amostras durante a gravidez tem proporcionado importanteinformação sobre alterações no ácido graxo e complexo homeostase lipídica 3.
Antes da separação cromatográfica, os lípidos são tipicamente extraída da amostra, utilizando a solubilidade dos lípidos em misturas de solventes de clorofórmio e metanol. O cloreto de sódio é adicionado a fim de facilitar a separação da mistura de lípidos em solução aquosa e orgânica contendo 9,10 fases. Classes de lípidos complexos de interesse podem ser separados a partir do extracto de lípido total por extracção de fase sólida (SPE). Esta técnica de separação elui classes de lipídios com base em sua polaridade ou afinidade de ligação. Triacyglycerols (TAG) e éster de colesterol (EC) são eluidos primeiro como uma fracção combinada, outras classes, a fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), e os ácidos gordos não esterificados (NEFA) são eluídas por aumento da polaridade do solvente de eluição . A separação do TAG da CE explora a ligação da TAG apenas a um cartri SPE frescodge, permitindo CE a ser eluído. TAG pode então ser eluída por aumento da polaridade do solvente de eluição 9,10. Este método permite que várias amostras a serem separados, simultaneamente, com um rendimento mais elevado do que é conseguido com a cromatografia em camada fina, o que significa que relativamente pequenas amostras de tamanho (por exemplo, <100 ul de plasma ou soro, <100 mg de tecido) podem ser analisados 11,12.
CG é uma técnica bem estabelecida primeiro descrita em 1950, e foi sugerido que a fase móvel, em seguida, os sistemas de líquido-líquido pode ser substituído por vapor. Ele foi inicialmente usado para a análise de petróleo, mas rapidamente se expandiu para outras áreas, como análise de aminoácidos e bioquímica lipídica, que ainda é de grande interesse. Avanços na tecnologia e equipamento de GC, como o desenvolvimento de colunas capilares das colunas empacotadas utilizadas anteriormente conduziu a nossas técnicas actuais, em que os ácidos gordos são capazes de serseparadas de forma mais eficiente a baixas temperaturas, resultando em GC sendo rotineiramente utilizado para identificar e quantificar os ácidos gordos numa vasta gama de investigações 13.
GC requer ácidos gordos de ser derivatizados de modo que eles podem tornar-se suficientemente volátil para ser eluída a temperaturas razoáveis sem decomposição térmica. Isto normalmente envolve a substituição de um grupo funcional contendo hidrogénio para formar ésteres, tioésteres ou amidos para análise. Os ésteres metílicos são vulgarmente estudada derivados, os quais são produzidos por metilação. Neste método, as ligações éster em lípidos complexos são hidrolisados para libertar os ácidos gordos livres, que são transmethylated para formar os ésteres metílicos dos ácidos gordos (FAME). O perfil resultante de FAME, determinada por GC, é referida como a composição de ácidos gordos e podem ser facilmente comparadas entre os diferentes grupos experimentais 9,10. A técnica permite que ambas as proporções de indiácidos gordos e as suas concentrações ual a ser medido.
Em adição à utilização de GC para análise de ácidos gordos em estudos de nutrição e na indústria alimentar, a técnica pode ser utilizada numa vasta gama de campos de análise. Por exemplo, as análises ambientais utilizando GC incluem a medição da contaminação da água por inseticidas e análises do solo medição do teor de clorobenzeno. Em toxicologia, GC também tem sido utilizada para identificar substâncias ilegais na urina e amostras de sangue de indivíduos; um tal de aumentar o rendimento desportivo de 12 e a capacidade de separar misturas complexas de hidrocarbonetos torna esta técnica popular na indústria do petróleo para a análise petroquímica 12.
A gravidez está associada com alterações significativas na composição de ácidos graxos dos tecidos maternos, especificamente no conteúdo de ácidos graxos ômega-3 (n-3) e ômega-6 (n-6) aci graxos poliinsaturadosds (PUFA) 3. No estudo actual, que exemplificam o uso de GC na medição de ácidos gordos, descrevendo a sua utilização na análise da composição de ácido gordo do tecido do fígado de ratos virgens feita grávidas e alimentados com dietas de baixo e alto teor de gordura, com diferentes fontes de petróleo. As dietas experimentais foram fornecidas aqui uma dieta de baixa gordura à base de óleo de soja, uma dieta à base de óleo de soja rica em gordura (130,9 g Total de gordura / kg de gordura total) ou de uma dieta à base de óleo de linhaça rica em gordura (130,9 g Total de gordura / kg dieta), desde há 20 dias. A composição de ácidos gordos e nutrientes completo destas dietas têm sido descritos anteriormente 14. As dietas com óleo de soja são ricas em ácido linoleico (18:2 n-6) e conter algum ácido linolénico-α (18:3 n-3) ao passo que a dieta de óleo de linhaça é rico em ácido linolénico-α. Estas dietas de alta gordura representam diferentes rações de linoléico para α-linolênico (rações de 08:01 e 01:01, respectivamente). O método para o isolamento de classes de lípidos individuais e análise por GC que éll estabelecido e validado, e tem sido publicado anteriormente 10, mas sem a descrição técnica pormenorizada aqui encontrados.
Protocol
Representative Results
Discussion
A cromatografia gasosa é uma técnica precisa de usar para análise de ácidos graxos, e sua alta reprodutibilidade considere esta técnica adequada para análises clínicas. Colunas GC apropriadas deve ser utilizado para permitir a identificação dos ácidos graxos de interesse, com colunas disponíveis tendo variações na polaridade da fase estacionária, o comprimento da coluna e do diâmetro interno. A utilização de uma coluna capilar de sílica fundida no presente método de análise proporciona uma boa estabi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a contribuição de Meritxell Romeu-Nadal para o estudo ratos.
Materials
| Methanol: | Fisher Scientific | M/4056/17 | 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade |
| Chloroform: | Fisher Scientific | C/4966/17 | 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade |
| BHT: | Sigma- Aldrich | W218405 | 'CAUTION' Dust fumes – Anhydrous |
| NaCl | Sigma- Aldrich | S9888 | Anhydrous |
| Hexane | Fisher Scientific | H/0406/17 | 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade |
| Glacial acetic acid | Sigma- Aldrich | 695084 | 'CAUTION' Burns – 99.85% |
| Sulfuric acid | Sigma- Aldrich | 339741 | 'CAUTION' Burns – 99.999% |
| Potassium carbonate | Sigma- Aldrich | 209619 | 99% ACS Reagent grade |
| Potassium bicarbonate | Sigma- Aldrich | 237205 | 99.7% ACS Reasgent grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10204340 | 'CAUTION' Fumes – 99+% GLC SpeciFied |
| Toluene | Fisher Scientific | T/2300/15 | 'CAUTION' Fumes |
| Diethyl ether | Sigma- Aldrich | 309966 | 'CAUTION' Fumes |
| Nitrogen (oxygen free) cylinder | BOC | 44-w | 'CAUTION' Compressed gas – explosion risk |
| Aminopropyl silica SPE cartridges | Agilent | 12102014 | Cartridge – Bead mass 100mg |
| Silica gel SPE cartidges | Agilent | 14102010 | Cartridge – Bead mass 100mg |
| Molecular seives | Sigma- Aldrich | 334324 | Pellets, AW-300, 1.6mm |
| Glass pasteur pipettes | Fisher Scientific | FB50251 | |
| Borosilicate glass test tube | Fisher Scientific | FB59527 | Non-screw cap |
| Screw thread glass test tubes | Fisher Scientific | FB59555 | 13mm |
| Caps for screw thread test tubes | Fisher Scientific | FB51353 | To fit 13mm tube |
| Solida phase extraction (SPE) tank | Agilent | VacElut 20 Manifold | |
| Luer stopcocks for SPE tank | Agilent | 12131005 | |
| Vacuum pump | Sigma- Aldrich | 2656-194GB-1EA | |
| GC vials | Kinesis | STV 12-03TS | Short thread 9mm, TPX 0.2ml fused glass insert |
| GC vial lids | Kinesis | SCC09-0.2B | Short thread 9mm blue |
| GC inlet liners | SGE Analytical science | 092002 | Split/splitless Focus liner ID 4mm, OD 6.3mm length 78.5mm |
| GC septa | SGE Analytical science | 041856 | 11mm, MN material |
| GC column | SGE Analytical science | 054612 | Length 30m, ID 0.22mm, Film thickness 0.25µm |
| Gas chromatograph | HP 6890 series |
Riferimenti
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