異種発現および嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)の精製は、重大な課題および嚢胞性線維症のための薬物療法の開発における制限因子である。このプロトコルは、機能的および構造的研究に適しCFTRのミリグラム量の単離のための2つの方法について説明します。
嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)の欠陥は、タンパク質嚢胞性線維症(CF)、現在の年齢<40歳までの患者の平均寿命を制限し、常染色体劣性疾患を引き起こす。 CFTRの活性を回復させる新規な薬物分子の開発は、治療CFにおける重要な目標であり、機能的に活性なCFTRの単離は、この目標の達成に向けて有用なステップである。
我々は、S.、真核生物の異種発現系からCFTRを精製するための二つの方法を記載サッカロミセス·セレビシエ 。原核生物系と同様に、S.セレビシエは急速に低コストで実験室で増殖させることができるだけでなく、トラフィックおよび翻訳後の大きな膜タンパク質を修飾することができる。可溶化および精製のための界面活性剤の選択は、任意の膜タンパク質の精製における重要なステップである。いくつかの洗剤にCFTRの溶解性のためにスクリーニングしたので、我々は2人の共同を選択した最終的なCFTRの準備がその後、計画の実験に合わせて調整することを可能にする精製に使用するための洗剤ntrasting。
この方法では、ドデシル-β-D-マルトシド(DDM)中のCFTRの精製の 比較および1 -テトラデカノイル-sn-グリセロ-3 -ホスホ-(1'- てrac-グリセロール)(LPG-14)を提供する。この方法により、DDMに精製されたタンパク質は、機能アッセイにおけるATPアーゼ活性を示す。 LPG-14で精製されたタンパク質は、高純度および収率を示し、翻訳後修飾を研究するために用いることができ、例えば小角X線散乱および電子顕微鏡法のような構造を用いることができる。しかし、それはかなり低いATPアーゼ活性を示す。
嚢胞性線維症(CF)は2500出生約1の発生率とヨーロッパと北アメリカで最も一般的な遺伝性疾患である。 CFは発生したときに、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)1上皮細胞の原形質膜でのその機能のタンパク質の損失の原因における変異。この欠陥の最も深刻な結果は、年齢2,3 <40年に患者の平均寿命が短くなり、不可逆的な肺の損傷です。
CFTRは、イオンチャネル1,4になるように進化しているATP結合カセット(ABC)トランスポーターである。細胞の原形質膜におけるそのかなり変化した機能にもかかわらず、さらに他のABC輸送体と有意な配列相同性を保持する。興味深いことに、CFTRの専門的な部分( すなわち 、その調節領域およびそのN末端 およびC末端)は、他の後生動物ABCトランスポーターとの有意な配列類似性を共有しない、それゆえ目について何ら手がかりはありませんCFTRにおけるこれらの配列のeが起源。その一次構造に基づいて、CFTRは、ABCトランスポーターファミリーのCファミリーのメンバーとして分類されますが、このサブファミリーに残留の機能的結合のための強力な証拠は存在していません。他のレポートは、還元型グルタチオンはなく表示よりも、CFTR ATPアーゼ活性を阻害する可能性があることを示唆しているが、他のC-ファミリーのメンバー8,9の役割と一致するであろう、これCFTR 5-7のためのグルタチオン輸送活性のいくつかの報告がなされているABCトランスポーター10を特徴付ける基板によって誘発される刺激。イオン伝導度の測定は、単一CFTR分子のチャンネル活性は、1を研究すると、CFTRチャネル特性は時間の関数、温度、ATP濃度、膜電位、およびリン酸化状態、ならびに同様に監視されている可能にするのに十分に敏感である小分子阻害剤、増強、および修飾子のホストが存在する。これらの研究はまた、ABCトランスポーターは、どのように機能するかについての我々の知識に大きく追加されました。それにもかかわらず、かなりの量のCFTRの発現およびその後の精製は特に困難であることが証明された成功は、いくつかの研究室10〜13に制限されてきた。
より効果的な薬物を開発する必要性が押圧されて、まだ、このプロセスは、小分子をスクリーニングするための精製されたCFTRの欠如によって妨げられてきた。 CFTRの発現および精製の問題を解決することは、CFにおける主要な欠陥の修正を目的としたハイスループット薬剤スクリーニングを可能にし、また合理的なドラッグデザインを通知するために、高解像度の構造研究のためのルートを開くだろう。さらに、そのようなその機能オリゴマー状態のようなタンパク質、タンパク質相互作用し、ATPアーゼ活性の比較的基本的な生化学的特性は、特徴付けが乏しいまま。我々は以前、GFP-およびHisタグマウスCFTRの大量発現のためのプロトコルを報告しているS.中サッカロミセス·セレビシエ 14は 、今、さらにCFTRの精製の ためのプロトコルを記述します。ここでは、例として、鶏のCFTRの精製のために5 CFTRのオルソログ、および現在のデータを浄化するために、これらのメソッドを使用している。可溶化および精製のための界面活性剤の選択は、任意の膜タンパク質の精製における重要なステップである。いくつかの洗剤にCFTRの溶解性のためにスクリーニングしたので、我々は精製に使用するために2対照的な洗剤を選択しました。ドデシル-β-D-マルトシド(DDM)広範囲の膜タンパク質15-21の構造的および機能的研究の両方のために使用されている非イオン性界面活性剤である。イオン性界面活性剤1 -テトラデカノイル-sn-グリセロ-3 -ホスホ-(1'- てrac-グリセロール)(LPG-14)は、CFTRの可溶化に非常に効率的であり、以前に機能的な膜タンパク質10の精製に使用されているSからCFTRの精製を含む22,23、 サッカロミセス·セレビシエ24。</ pの>
我々は以前、マウスCFTR 14の過剰発現のための方法を記載している。そのプロトコルの公開以来、我々は、同じ発現系を用いてCFTRのいくつかの異なる相同分子種を精製している。 DDM精製が異なるオルソログを横切る複数のバリエーション(データは示さず)を示した一方で、試験した全てのオルソログは、これまで、LPG洗剤でよく精製した。この柔軟性は、酵母のアプローチの強さを示しています。それは、特定の目的のための1つを選択するために、相対的な速さで多くの構造物をスクリーニングすることが可能である。
クリーナーミクロソーム準備でのDDMの結果による可溶化する前に、1MのNaClを含む緩衝液で酵母ミクロソームを洗浄し、後の段階での汚染物質を低減します。最終的なCFTRサンプルはミクロソーム洗浄なしで> 90%の純度であるため、このステップでは、LPGプロトコルは不要である。さらに、DDMでの精製は、可溶化A用のバッファには、いくつかの変更を必要とするND浄化、余分なグリセリン、塩、すなわちほか。一緒に、これらの追加はかなりの列にDDM可溶化タンパク質の結合を増加させた。
DDM精製方法は改善の余地を有しており、特に、質量分析により判断し、40kDaの主要な汚染物質の除去は、ニッケル樹脂に対する固有の親和性を有すると思われる酵母リボソームサブユニットL3、に起因する。そこL3タンパク質における明らかなポリHis配列はないが、リボソーム(PDB = 1FFK)に結合し、その3次元構造の検査は、折り畳まれたL3サブユニットが潜在的なポリHisクラスタを有することを示している。このバンドは、LPG精製物質はあまり問題があると厳しいLPG用洗剤に起因する可能性がある。
DDMでの精製は、LPGに比べて劣るように見えるけれども、そのようなDDMなどの穏やかな洗剤は、機能と構造解析との互換性があり、すでにいくつかのX線crystallで使用されてきた膜タンパク質15-21のographic研究。さらに、我々の結果は、LPGの使用は、DDMで精製に対するCFTRの相対的なATPアーゼ機能の損失につながることが示された。したがって我々はそのような翻訳後修飾の特性評価などのアプリケーションで、たとえば、純度が非常に重要であるCFTRの世代のために、LPGベースの精製プロトコルを推薦するか、または抗体の生成において、LPGベースのプロトコルが選択されるであろう。タンパク質の活性と完全に天然の状態が不可欠なアプリケーションでは一方で、私たちはより良いオプションとしてDDMベースのプロトコルを提案する。
結論するには、このプロトコルは、両性イオン性界面活性剤、LPG-14または非イオン性界面活性剤DDMにCFTRの単離のための再現可能な方法を説明します。そのため、それ以前に10月13日に報告されているよりも、CFTRの精製条件のより大きな範囲を示している。また精製されたCFTRのミリグラム量は、することができます例えば、20 Lの発酵槽と、このような6 L低速遠心ロータのような高容量の電池回収システムのような高容量酵母増殖·システムと組み合わせた場合、これらの手順を使用して得られた。得CFTRは、様々な生化学的および生物物理学的アッセイにおけるタンパク質の容易な監視を可能にする切断可能なGFPタグを持っています。
本稿(ニワトリCFTRを含むプラスミドまたは凍結酵母細胞)に記載された試薬は、嚢胞性線維症財団(USA)により得ることができる。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、そのCFTR 3D構造のコンソーシアムを通じて米国嚢胞性線維症財団(CFF)によって賄われていた。 TRは英国BBSRCの学生の身分で、英国のCF信託学生の身分、およびNCによって資金を供給された。私たちは、彼らの助けやアドバイスをしてコドン最適化鶏のCFTRシーケンスおよび精製タグの設計のためのCFFのCFTR 3D構造コンソーシアムの私達の仲間を認める。
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane) | Vivaspin | VS0641 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
40Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP) | Sigma-Aldrich | A26209 |
Liquid chromatography system | GE Healthcare | 28-4062-64 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Glass bead-beating cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5417R |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent | BioRad | 152-3920 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
Gel imaging system | BioRad | 170-808 |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
E.coli total lipid extract | Avanti lipids | 100500 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
Glycerol | Fisher | 65017 |
HisTrap HP columns (5 ml) | GE Healthcare | 17-5247-05 |
Rapid Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Centrifuge JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG) | Avanti lipids | 858120 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 |
Gel tank SDS-PAGE system | BioRad | 165-8006 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310S |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
Prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
Desalting columns (Sephadex G-25) | GE Healthcare | 17-0851-01 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Sch28080 | Sigma-Aldrich | S4443 |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L37771 |
Sodium thiocyanate (NaSCN) | Sigma-Aldrich | 251410 |
Gel filtration 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
Vortex mixer | Star Labs | N2400-0001 |
Ultrasonic water bath | Ultrawave | F0002202 |
Multimode plate reader | BioTek | BTH1MF |