हम इस लेख में जटिल anisotropic द्विअक्षीय यांत्रिक विरूपण करने के लिए एकल कक्ष प्रतिक्रियाओं की जांच और जैविक ऊतकों के यांत्रिक गुणों यों इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक उपन्यास खींच मंच प्रस्तुत करते हैं.
कोशिकाओं और ऊतकों को यांत्रिक बलों के आवेदन या कि अनुमति देने के उपकरण है कि जैविक ऊतकों के यांत्रिक गुणों बुनियादी mechanobiology को समझने के लिए नाटकीय रूप से योगदान दिया है यों कर सकते हैं. इन तकनीकों में बड़े पैमाने पर विभिन्न रोगों की शुरुआत प्रगति भारी यांत्रिक cues से प्रभावित हैं कैसे प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यह लेख यंत्रवत् एकल कोशिकाओं को उत्तेजित या ऊतकों के यांत्रिक कठोरता यों सकता है कि या तो एक बहुआयामी द्विअक्षीय खींच (BAXS) मंच प्रस्तुत करता है. BAXS मंच स्वतंत्र रूप से नियंत्रित किया जा सकता है कि चार आवाज का तार मोटर्स के होते हैं. एकल कक्षों एक जटिल गतिशील, और स्थानिक अलग तनाव क्षेत्रों के लिए कोशिकाओं को बेनकाब करने के लिए अनुमति मोटर्स से जुड़ा जा सकता है कि एक लचीला सब्सट्रेट पर संवर्धित किया जा सकता है. इसके विपरीत, एक बल लोड सेल को शामिल करके, एक भी वे विरूपण चक्र को उजागर कर रहे हैं के रूप में प्राथमिक ऊतकों के यांत्रिक गुणों यों कर सकते हैं.दोनों ही मामलों में, clamps के एक उचित सेट तैयार किया जाना चाहिए और मजबूती से लचीला सब्सट्रेट या हित के ऊतक पकड़ के क्रम में BAXS मंच मोटर्स के लिए मुहिम शुरू की. BAXS मंच खींच प्रयोगों के दौरान नमूने के संरचनात्मक या जैव रासायनिक प्रतिक्रिया की जांच के लिए एक साथ प्रेषित प्रकाश और / या प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप पर रखा जा सकता है. यह लेख BAXS मंच के डिजाइन और उपयोग की प्रायोगिक जानकारी प्रदान करता है और एकल कक्ष और पूरे ऊतक के अध्ययन के लिए परिणाम प्रस्तुत करता है. BAXS मंच तनाव सब्सट्रेट करने के लिए और पृथक माउस aortas की कठोरता को मापने के जवाब में एक माउस myoblast कोशिकाओं में नाभिक के विरूपण को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था. BAXS मंच उप सेलुलर, सेलुलर और पूरे ऊतक के स्तर पर उपन्यास mechanobiological अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए विभिन्न ऑप्टिकल microscopies के साथ जोड़ा जा सकता है कि एक बहुमुखी उपकरण है.
यांत्रिक microenvironment ऊतकों के विकास और homeostasis में और भी बीमारियों 1-6 में एक गहरा प्रभाव पड़ता है जो इस तरह के प्रसार, प्रवास, और भेदभाव के रूप में कई सेल काम करता है, में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. इन वर्षों में, प्रयोगात्मक उपकरणों की एक भीड़ यंत्रवत् कोशिकाओं या ऊतकों को प्रोत्साहित और बुनियादी mechanobiology के बारे में हमारी समझ को बढ़ाने और रोगों 6-17 की शुरुआत प्रगति का अध्ययन करने के लक्ष्य के साथ जैविक ऊतकों के यांत्रिक गुणों को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, एक बार एक विशेष अध्ययन के लक्ष्यों को प्राप्त करने के लिए कई अलग अलग प्रयोगात्मक उपकरणों पर भरोसा करना चाहिए. इस अनुच्छेद के यांत्रिक गुणों और यांत्रिक बलों पूरे ऊतक लंबाई तराजू को उप सेलुलर जीव विज्ञान में खेलने कि भूमिका की जांच कि पढ़ाई के लिए अनुमति देता है एक एकल, बहुआयामी, द्विअक्षीय खींच (BAXS) मंच प्रस्तुत करता है. BAXS मंच quantificatio के लिए अनुमति देता है न केवलयह भी यांत्रिक पृथक ऊतकों के गुण, लेकिन एन कि vivo में होता खींच लिए उनकी प्रतिक्रियाओं को समझने के क्रम में जीवित कोशिकाओं के लिए, सरल, जटिल और गतिशील तनाव के खेतों लागू करने की क्षमता की सुविधा. BAXS मंच भी कोशिकाओं और ऊतकों पर यांत्रिक परीक्षण और perturbations के दौरान रहते सेल माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करने की क्षमता रखता है.
BAXS मंच सेलुलर स्तर पर सब्सट्रेट विरूपण के प्रभाव की जांच और जैविक ऊतकों (चित्रा 1 ए) पर तन्यता परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक कस्टम निर्मित उपकरण है. एक एल्यूमीनियम हीटर एक मानक 10 सेमी पेट्री डिश को समायोजित और एक तापमान नियंत्रक और Kapton हीटर (चित्रा 1 बी) का उपयोग कर 37 डिग्री सेल्सियस पर किसी भी शारीरिक समाधान बनाए रखने के लिए निर्मित किया गया था. इस BAXS मंच एक औंधा चरण विपरीत और / या प्रतिदीप्ति खुर्दबीन पर एकीकृत और एक साथ इमेजिंग (चित्रा 1C) के लिए अनुमति देता है किया जा सकता है.संक्षेप में, BAXS मंच चलती भागों सीधा दो कुल्हाड़ियों (चित्रा -1) के साथ उन्मुख लघु रेखीय गति गेंद असर स्लाइड पर बढ़ रहे हैं, जिनमें से चार रेखीय आवाज का तार मोटर्स के होते हैं. एक रेखीय पोजीशनिंग मंच (चित्रा 1E) का उपयोग किया जाएगा कि clamping प्रणाली के ऊर्ध्वाधर आंदोलन की अनुमति के लिए चार मोटरों में से प्रत्येक के लिए मुहिम शुरू की है. प्रत्येक मोटर की स्थिति 500 एनएम के एक संकल्प (चित्रा 1F) के साथ एक ऑप्टिकल एनकोडर द्वारा नजर रखी है. सभी चार मोटर्स स्वतंत्र रूप से गति आदेशों (चित्रा 1G) निष्पादित करने के लिए ऑप्टिकल एनकोडर प्रतिक्रिया को रोजगार एक गति नियंत्रक के साथ नियंत्रित कर रहे हैं. एक LabVIEW अंतरफलक कोशिकाओं या ऊतकों के नमूनों की, पूरी तरह से अनुकूलन स्थिर और गतिशील विकृति उत्पन्न करने के क्रम में विस्थापन परिमाण, गति, और प्रत्येक मोटर की गति पर पूरा नियंत्रण प्रदान करता है.
कोशिकाओं में एक विकृति उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल की तकनीक बस allowin द्वारा हासिल की हैजी कोशिकाओं को मजबूती से एक लचीला और पारदर्शी सब्सट्रेट का पालन करना और फिर BAXS मंच की चार मोटरों का उपयोग इस सब्सट्रेट खींच लिए. BAXS मंच आवाज का तार मोटर्स पर सब्सट्रेट संलग्न करने के लिए clamps के किसी भी कस्टम डिजाइन सेट के बढ़ते अनुमति देता है. इस प्रयोजन के लिए, हम polydimethylsiloxane (PDMS) से बना एक लचीला और पारदर्शी सब्सट्रेट,, (आंकड़े 2A सी और चित्रा 3) के साथ संलग्न किया जा सकता है जिसके लिए clamps के एक सेट बनाया गया. Clamps शारीरिक समाधान को उजागर किया जाएगा, सभी भागों नसबंदी के लिए अनुमति देने के लिए स्टेनलेस स्टील से machined थे. इन clamps ध्यान से (चित्रा 2 डी) खींच दौरान सब्सट्रेट पर तनाव को कम करते हुए छवि गुणवत्ता बढ़ाने के लिए खुर्दबीन उद्देश्य के लिए संभव के रूप में बंद सब्सट्रेट लाने के लिए डिजाइन किया गया है.
एक ही BAXS मंच भी ADAP साथ clamps के एक उचित सेट का उपयोग, छोटे ऊतकों के नमूनों की कठोरता यों इस्तेमाल किया जा सकता हैटेड ऊतकों के नमूनों और बलों की निगरानी के लिए एक लोड सेल के लिए समर्थन करता है. कई तरीकों BAXS मंच मोटर्स के लिए एक ऊतक माउंट करने के लिए लिया जा सकता है; इस मामले में स्टेनलेस स्टील कीट minutiens पिंस तन्यता परीक्षण (आंकड़े -4 ए बी) प्रदर्शन करने के क्रम में संवहनी ऊतकों के उद्घाटन के माध्यम से हुक कर सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, एक प्राकृतिक खोलने के बिना मोटी ऊतकों के लिए, ऊतक किनारों या तो आवाज का तार मोटर्स से जुड़ी या जैविक गोंद के साथ छोटे गिलास स्लाइड से चिपके और clamps के साथ मोटर्स से जुड़ी clamps के साथ स्थिति में आयोजित किया जा सकता है. तन्यता प्रदर्शन करने के क्रम में एक लघु लोड सेल आवश्यक है जांचता है और आसानी से BAXS मंच मोटर्स पर शामिल है और एक खींच चक्र (चित्रा 4C) के दौरान ऊतकों पर अभिनय बल को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. BAXS मंच चार मोटर्स से बना है के रूप में, एक दूसरे लोड सेल की शुरूआत एक दो orthogonal दिशाओं साथ तनन परीक्षण प्रदर्शन करने की अनुमति देता है. यह क्षमता एक quantif करने की अनुमति देता हैY ही प्रयोग के दौरान दो सीधा दिशाओं के साथ एक एकल ऊतक के यांत्रिक कठोरता.
महत्वपूर्ण बात है, सभी विन्यास में, कोशिकाओं या ब्याज के ऊतकों के नमूनों हमेशा उपयोगकर्ता के लिए सुलभ है कि एक तापमान नियंत्रित स्नान में रखा जाता है. इस क्षमता का नमूना के अस्थायी प्रतिक्रिया की जांच के क्रम में खींच नमूना दौरान औषधीय एजेंटों की शुरूआत के लिए अनुमति देता है. उलटा माइक्रोस्कोप के ऑप्टिकल अक्ष अबाधित रहता है के रूप में इसके साथ ही, माइक्रोस्कोपी के सभी रूपों अभी भी उपयोगकर्ता के लिए उपलब्ध हैं. BAXS मंच के सभी चार मोटर्स स्वतंत्र हैं के रूप में अंत में, यह ब्याज के नमूने के लिए उच्च विन्यास तनाव क्षेत्रों को लागू करने के लिए संभव है. में vivo कोशिकाओं और ऊतकों को उजागर कर रहे हैं जटिल और विरोध के रूप में है कि इस मंच में अधिक उचित रूप से मजाक उड़ाया जा सकता खींच anisotropic पारंपरिक अक्षीय खींच मंच 7,13,15,18,19 लिए. इसके अलावा, शारीरिक विशेषताओंतनाव क्षेत्र की एक प्रयोग के दौरान उड़ान पर बदला जा सकता है. इन क्षमताओं उपयोगकर्ता एक अस्थायी अत्यधिक जटिल, anisotropic की व्यापक संख्या, और स्थानिक अलग तनाव क्षेत्रों के लिए सेलुलर और ऊतक स्तर प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए अनुमति देते हैं. इस अनुच्छेद के फायदे और सीमाएं BAXS मंच के साथ ही इसकी डिजाइन, ऑपरेटिंग सिद्धांतों, और एकल कक्ष और पूरे ऊतक प्रयोगों के लिए प्रयोगात्मक विवरण का वर्णन करता है.
BAXS मंच की चित्रा 1. अवलोकन. चार आवाज का तार मोटर्स मंच प्रदर्शन करने के लिए जीना एक औंधा माइक्रोस्कोप पर रखा जा सकता है) में 37 डिग्री सेल्सियस सेल्सियस पर कोशिकाओं और ऊतकों को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया पेट्री डिश हीटर की. बी) विस्तृत चित्र दिखा BAXS मंच की ए) शीर्ष देखें खींच प्रयोगों के दौरान सेल इमेजिंग.डी) आवाज का तार मोटर की विस्तृत तस्वीर; clamping सिस्टम गति नियंत्रक. जी) विस्तृत चित्र के लिए मोटर की वास्तविक समय स्थिति प्रदान करता है कि ऑप्टिकल एनकोडर की. एफ) विस्तृत चित्र के ऊर्ध्वाधर विस्थापन की अनुमति रेखीय पोजीशनिंग मंच के मंच से चलती हिस्सा. ई) विस्तृत चित्र चार आवाज का तार मोटर्स को चार ऑप्टिकल एनकोडर जानकारी और बिजली outputs दिखा गति नियंत्रक की.
चित्रा 2. सेल खींच प्रयोगों के लिए प्रणाली clamping. सब्सट्रेट इसके प्रस्तोता featur साथ दबाना का बेलनाकार हिस्से के चारों ओर लपेटा जाता है. सी) खींचने के लिए आवाज का तार मोटर्स को PDMS सब्सट्रेट देते थे clamps के विवरण दिखा एबी) चित्रतों शीर्ष पर नाली में बैठे. फिर सब्सट्रेट शीर्ष नाली में सुविधाओं प्रस्तोता / सब्सट्रेट धक्का कि setscrews का उपयोग कर सुरक्षित है. Clamps जगह में सब्सट्रेट जोत के साथ BAXS मंच की डी) चित्रण. इनसेट इसे से जुड़ी कोशिकाओं सिर्फ एक कवर पर्ची और खुर्दबीन उद्देश्य ऊपर बैठा के साथ सब्सट्रेट की एक विस्तृत विवरण से पता चलता है.
चित्रा 3. झिल्ली और उसके clamping प्रणाली की सामग्री के बिल. प्रिंसिपल भागों के आयाम दिखा चित्र सेल खींच प्रयोगों प्रदर्शन करने द्विअक्षीय मंच को एकीकृत.
चित्रा 4. पूर्वछोटे कैलिबर जहाजों की कठोरता आकलन एक 1 मिमी व्यास माउस महाधमनी में विकृति उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया clamping प्रणाली की. एबी) विस्तृत चित्र के लिए एक clamping प्रणाली की पर्याप्त. स्टेनलेस स्टील पिंस ध्यान से पोत दोनों पिंस पर clamps पोत और तय मोटर और बाईं दबाना बीच संलग्न एक लोड सेल में रखने के साथ BAXS मंच की. सी) चित्रण स्लाइड करने की अनुमति के लिए खुला त्रिकोण में आकार थे. इनसेट पिन पर घुड़सवार पोत की एक विस्तृत ऊपर से देखने से पता चलता है.
यहाँ प्रस्तुत BAXS मंच एकल कक्षों की जांच से पूरे ऊतकों को, mechanobiology के अध्ययन में कई प्रयोगों की सुविधा. इसके अलावा, मंच कई यांत्रिक उत्तेजना प्रयोगों और बहु - अक्षीय तनन परीक्षण के लिए अनुमति देता है, अत्य?…
The authors have nothing to disclose.
डीटी ले Fonds डे Recherche डु क्यूबेक प्रकृति एट टेक्नोलॉजीज (FQRNT) और एक MITACS तरक्की सामरिक फैलोशिप से एक postdoctoral छात्रावस्था द्वारा समर्थित किया गया. सीएमसी ले Fonds डे Recherche एन SANTE डु क्यूबेक (FRSQ) और अर्नेस्ट और ओटावा हार्ट इंस्टीट्यूट के विश्वविद्यालय से मार्गरेट फोर्ड कार्डियोलॉजी संपन्न अनुसंधान फेलोशिप से एक postdoctoral छात्रावस्था द्वारा समर्थित किया गया. EOB संचालन अनुदान स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए कनाडा संस्थान (CIHR) से MOP80204 और दिल से T6335 और ओंटारियो के स्ट्रोक फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया. CIHR और Medtronic सामूहिक रूप से एक सहकर्मी की समीक्षा रिसर्च चेयर (URC # 57093) के साथ EOB प्रदान करते हैं. एईपी प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC) डिस्कवरी अनुदान, एक NSERC डिस्कवरी त्वरक अनुपूरक द्वारा वित्त पोषित है और कृतज्ञता कनाडा अनुसंधान अध्यक्षों (सीआरसी) कार्यक्रम और ओंटारियो प्रांत से एक प्रारंभिक शोधकर्ता पुरस्कार के समर्थन मानता है.
PDMS | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your |
FluoSpheres fluorescent microspheres | Invitrogen | F8810 | Keep away from light. |
Linear voice coil | Moticont | LVCM-051-051-01 | The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional. |
Ball bearing slide | Edmund Optics | NT37-360 | Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides |
linear positioning stage | Edmund Optics | 38-960 | Center Drive 1.25" Square Linear Translation Stages |
optical encoder | GSI microE systems | Mercury II 1600S – 0.5um resolution | reflective incremental encoder. |
motion controller | Galil | DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440 | 4 axis controller with a 4 axis amplifier |
load cell | Honeywell | 31 low | miniature load cell with a range of 0-150 g |
Insect minutiens pins (0,20mm) | Pin Service Austerlitz Insect pins | Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape | |
SU-8 2050 | Micro Chem | SU-8 2050 | Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light |
Air-plasma treatment system | Glowresearch | Autoglow Oxygen Plasma System | |
Rat-tail collagen | Invitrogen | A10483-01 | Collagen I, Rat Tail 5mg/ml |
Hoechst 33342 | Invitrogen | R37605 | DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge. |
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters | omega.ca | KHLV-0504/(10)-P | 28V flexible heaters; can be supplied with a 24V |
1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers | omega.ca | CN63200-R1-LV | Temperature controller; supply 24 V. |
DMEM culture medium | Hyclone | SH3024301 | Dulbecco’s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 C |
Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | Keep stock frozen. Keep working solution at 4 C. |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH3039603C | Keep frozen. |
Trypsin 0,05% | Hyclone | SH30236,02 | Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation |
Hepes | Wisent Inc | 330-050-EL | HEPES-buffered salt solution |
NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
CaCl2 | Fisher Scientific | C614-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
Dextrose | Fisher Scientific | BP220-1 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | Krebs physiological solution |
KH2PO4 | Fisher Scientific | BP362-500 | Krebs physiological solution |
Carbogen 95% O2/ 5% CO2 | Lindle | DIN:02154749 | Krebs physiological solution oxygenation |
Nocodazole | Sigma | M1404 | Microtubules depolymerization agent |
Cytochalasin-D | Sigma | C8273 | Actin filaments depolymerization agent |
Anti-α-SMA-FITC | Sigma | F3777 | Used to stain and quantify smooth muscle cells content |
Picrosirius red stain | Fluka | 43665 | Used to stain and quantify collagen content |