Anwendung von Retinsäure zu Osteozyten Kulturen aus primären Maus-Osteoblasten erhalten
Summary
Die Behandlung der primären Maus Osteoblasten mit Retinsäure erzeugt eine homogene Population von verzweigten Zellen, die morphologischen und molekularen Merkmalen des Osteozyten. Das Verfahren überwindet die Schwierigkeiten bei der Erlangung und Aufrechterhaltung der primären Knochenzellen in Kultur, und kann vorteilhaft sein, Zellen aus transgenen Modellen abgeleitet studieren.
Abstract
Die Notwendigkeit für osteocyte Kulturen ist gut für die Gemeinschaft der Knochenforscher bekannt; Isolierung von primären Knochenzellen ist schwierig und produziert niedrigen Zellzahlen. Daher ist die am meisten verwendete Zellsystem die Osteozyten-ähnliche MLO-Y4-Zelllinie.
Das hier beschriebene Verfahren bezieht sich auf die Verwendung von Retinsäure, um eine homogene Population von Zellen, die mit verzweigten morphologischen und molekularen osteocyte Eigenschaften zu erzeugen.
Nach Isolierung von Maus-Calvaria Osteoblasten, ist all-trans-Retinsäure (ATRA) zur Zellmedium zugegeben und Zellenüberwachung wird täglich unter einem Umkehrmikroskop durchgeführt. Erste morphologische Veränderungen nach 2 Tagen der Behandlung und Differenzierung nachweisbar ist im allgemeinen innerhalb von 5 Tagen vollständig, mit fortschreitenden Entwicklung von Dendriten, Verlust der Fähigkeit, die extrazelluläre Matrix zu erzeugen, die Herunterregulierung der Osteoblastenmarkern und Hochregulierung von Osteozyten-spezifischen Molekülen.
Inhalt "> Tägliche Zellenüberwachung ist wegen der inhärenten Variabilität der Primärzellen benötigt werden, und das Protokoll kann mit minimaler Variation, um Zellen von verschiedenen Mausstämmen erhalten und transgene Modelle angewendet angepasst werden.Das Verfahren ist einfach durchzuführen und erfordert keine spezielle Instrumentierung erforderlich, es in hohem Maße reproduzierbar ist, und erzeugt schnell eine ausgereifte Osteozyten Bevölkerung in vollständiger Abwesenheit von extrazellulären Matrix, was die Verwendung dieser Zellen für unbegrenzte biologische Anwendungen.
Introduction
Osteozyten, die häufigste Knochenzelltyp sind terminal differenzierte, hochverzweigten Zellen tief in das Skelett entfernt. Der Zellkörper der reifen Knochenzellen werden im Knochen Lücken enthalten und haben unterschiedliche Formen; Osteozyten mit länglichen Zellkörper sind in den kortikalen Knochen gefunden, während abgerundete Osteozyten sind häufiger in der trabekulären Knochen ein. Verzweigte Dendriten erstrecken sich vom Zellkörper und befinden sich in winzigen Kanälen Kanälchen genannt, bilden ein komplexes Netz, das mehrere Kontakte nicht nur mit anderen Osteozyten, sondern auch mit anderen Knochenzelltypen, Knochenmark, Blutgefäße und damit verbundene Perizyten macht. Durch die Lücken und Kanälchen in der interstitiellen Flüssigkeit enthalten, sind Osteozyten letztlich auch dem Umlaufsystem verbunden, deshalb sind sie nicht nur lokale, sondern auch systemische Ereignisse, und umgekehrt, ihr Verhalten kann sowohl von lokalen und systemischen Veränderungen 2 geregelt werden, beeinflussen können.
DieStudium der Osteozyten hat vor kurzem an Dynamik gewonnen, dank einiger technischer Verbesserungen, wie die Erzeugung von Gewebe-und zellspezifische transgene Tiere, die Verwendung von leistungsstarken Mikroskopie-Techniken und der Hochdurchsatz-Screening Molekular 3,4. Allerdings ist die Kenntnis dieser Zellen noch unvollständig, vor allem aufgrund der relativen Knappheit von angemessenen in vitro-Modellen. Eigentlich habe Osteozyten immer schwierig, wegen der tiefen Lage zu erhalten und zu pflegen in der Kultur, und das niedrige Niveau der Verbreitung, die eine solche differenzierte Zelltyp charakterisiert.
Entlang der Jahre eine Reihe von Methoden entwickelt worden, um primäre Knochenzellen 5-7 isolieren, obwohl sie produzieren in der Regel niedriger Zellausbeuten und tragen das Risiko, dass sogar ein paar verunreinigen Fibroblasten schnell überwuchern die Osteozyten 8. Aus diesem Grund sind die meisten experimentellen in vitro Arbeit wurde bisher auf die etablierten osteocyte Zelle l durchgeführtine MLO-Y4 9.
Weitere In-vitro-Methoden könnte die Möglichkeit der Untersuchung dieser Zellen zu erhöhen und könnte die Analyse der osteocyte Biologie und Pathophysiologie verbessern. Um weitgehend angenommen werden, sollten diese Methoden einfach zu reproduzieren, und würde nicht verlangen, spezielle Instrumente oder sehr lange Zeiten Zellreifung zu erreichen. Wichtig ist, wenn für Primärzellen, würden sie machen es möglich, die Vorteile von transgenen Tieren zu nehmen. Wir haben kürzlich beschrieben, dass die Behandlung der Osteoblasten-Zelllinie MC3T3-E1 und der primären Osteoblasten mit Retinsäure induziert eine rasche Änderung Phänotyp führt zu der Entwicklung einer homogenen Population von Zellen, die verzweigte morphologische und molekulare Merkmale von Osteozyten 10.
All-trans-Retinsäure (ATRA) ein aktives Stoffwechselprodukt von Vitamin A, die Gen-Transkription reguliert durch Bindung der Kern Retinsäure-Rezeptoren (RARs). RARan DNA binden als Heterodimere mit dem Retinoid-X-Rezeptoren (RXRs), letztlich auf die Modulation von Retinsäure (RA) ansprechenden Zielgene 11 führt. ATRA ist gezeigt worden, die Differenzierung und Reifung von mehreren Zelltypen zu modulieren, darunter andere verzweigte Zellen, wie Nervenzellen 12 und 13 podocytes.
Das hier beschriebene Verfahren wird nach Zugabe von ATRA an primären Osteoblasten basiert. Um wirksam zu sein, muss ATRA an einer präzisen Reifestufe auf Zellen in einem definierten Dichte ausplattiert hinzugefügt werden; Nach unserer Erfahrung diese Bedingungen sind für den Phänotyp Schalter von Osteoblasten Osteozyten erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
In den letzten Jahren hat sich die Osteozyten als die zentrale Zelle im Knochen entstanden. Fortschritte in der Forschung schrittweise enthüllt eine Reihe von bisher unbekannten oder unbewiesen osteocyte Eigenschaften, die für die Gestaltung von neuen und besseren Behandlung für eine Vielzahl von Knochenerkrankungen von enormem Wert sind. Allerdings hat die Untersuchung von osteocyte Biologie an der begrenzten Verfügbarkeit von in-vitro-Modelle leidet so sehr, dass Osteoblasten haben als Ersatzzellen über …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Finanzierung wurde von "Progetto ein concorso Fondazione Ospedale Maggiore Policlinico IRCCS 2009-2010", um MD, und Associazione Bambino Nefropatico ABN Onlus, Milano bereitgestellt
Materials
| Name | Company | Cat # | comments |
| Collagenase P | Roche Applied Science | 11213857001 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Pre-warm at 37°C before use |
| Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Pre-warm at 37°C before use |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Streptomycin/Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Protect ATRA from light |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in PBS and filter before use. Work always under a chemical hood. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Can be added to the secondary antibody |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Janus Green | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 176745 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| fluorsave | Calbiochem – Merck | 345789 | |
| Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5mm tips | World Precision Instruments | 501981 | |
| Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45mm tips | World Precision Instruments | 501978 | |
| Dissecting Scissors, straight,10cm curved | World Precision Instruments | 14394 | |
| Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| Culture flasks | Corning | 430168 | |
| Well-plates | Corning | 3335 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| microscope | Zeiss Apotome | ||
| spectrometer | Safas Xenius |
Riferimenti
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