In vitro-metod för att observera E-selektin-förmedlade interaktioner mellan Prostata cirkulerande tumörceller från patienter och humana endotelceller
Summary
Vår rapport beskriver en unik metod för att visualisera och analysera CTC / EC interaktioner i prostatacancer under fysiologiska flödesförhållanden.
Abstract
Metastas är en process vid vilken tumörceller skjul från den primära tumören intravasate blod vaskulära och lymfatiska systemet, varigenom, att få tillgång till extravasera och bildar en sekundär nisch. Kan studeras extravasation av tumörceller från blodet kärlsystemet med användning av endotelceller (ECS) och tumörceller erhållna från olika cellinjer. Initiala studier genomfördes med hjälp av statiska förhållanden, men det är väl dokumenterat att EC beter sig annorlunda under fysiologiska flödesförhållanden. Därför används olika flödeskammarpatroner som för närvarande används för att studera cancercellsinteraktioner med ECS. Nuvarande flöde kammar församlingar erbjuder reproducerbara resultat med hjälp av antingen olika cellinjer eller vätska vid olika skjuvning spänningsförhållanden. Men för att observera och studera interaktioner med sällsynta celler såsom cirkulerande tumörceller (CTCs) är vissa ändringar som behövs för att framställas med den konventionella flödeskammarenheten. CTCsär en sällsynt cellpopulation bland miljontals blodkroppar. Följaktligen är det svårt att erhålla en ren population av CTCs. Förorening av CTCs med olika typer av celler som normalt finns i cirkulationen är oundvikligt att använda nuvarande anrikning eller utarmning tekniker. I denna rapport beskriver vi en unik metod för att fluorescerande etikett cirkulerande prostatacancerceller och studera deras interaktioner med EC i en själv monterat flödeskammarsystem. Denna teknik kan tillämpas vidare att observera samspelet mellan prostata CTCs och något protein av intresse.
Introduction
Metastas är en komplex process i flera steg som förblir dåligt förstådda. Den E-selectin/selectin ligand-axeln har visat sig spela en viktig roll vid tumörmetastaser genom att främja primära adhesiva interaktioner mellan det vaskulära endotelet och cancerceller 1,2. Endothelial (E)-selektin är ett transmembrant protein som uttrycks av aktiverade endotelceller, medan olika E-selektin-ligand (er) uttrycks av tumörceller 3. Ett flertal in vitro-metoder har framgångsrikt använts för att modellera E-selectin/selectin ligand interaktioner mellan tumörceller och endotelceller (ECS) 1. För att studera dessa interaktioner är olika flödeskammarsystem som tillämpas för att simulera blod kärlsystemet. Bland flödeskammarpatroner, är parallella plattor flödeskammaren (PPFC) jämförd med ECS användes rutinmässigt som en in vitro-modell som simulerar in vivo skjuvspänning betingelser. I dettametod, EC odlas på en 35-mm skålen och efter att åstadkomma ett monolager, är EC bifogas PPFC och skjuvspänningen baserade experiment utförs.
Men PPFC och andra aktuella system presentera många begränsningar att studera självhäftande interaktioner mellan cirkulerande tumörceller (CTCs) härrör från patienter och EC, i första hand, eftersom CTCs är en sällsynt population av celler, skjul från den primära tumören, som cirkulerar bland miljontals blodceller (1 CTC per 10 9 blodkroppar) 4. Därför, till skillnad obegränsat utbud av odlade cellinjer, låg CTC räknar leder till mycket få och sällsynta CTC / EG-interaktioner, som kräver korrekt flöde kanalbredd för att registrera interaktioner för uppspelning analys. Dessutom, eftersom patienten härledda CTCs är en oren befolkningen, alltså en identifikationsmarkör krävs för att spåra CTCs i specifika. För att lösa detta problem har vi utvecklat en ny metod för att identifiera prostatacancer (PCA) CTCs, genom att ta fördel av det faktum att praktiskt taget alla dessa CTCs uttrycka prostataspecifikt membranantigen (PSMA) på sin cellyta 5,6. I denna rapport har vi använt prostatacancer cellinje, MDA PCa2b (MDA), för att visa potentialen nyttan av vårt nya system för att studera prostata CTC interaktioner med EC, så småningom att förstå mekanismen av metastaser.
Vår metod kan tillämpas för olika skjuvning baserade experiment som simulerar in vivo-kärlsystemet 7-9. Förutom att undersöka PCa CTC / EC interaktioner, kan strömflödet kammarsystemet enkelt anpassas för analys av perifera mononukleära blodceller eller tumörcellernas interaktioner med EC. Lättheten att demontering och återmontering av flödet kammaren, en Micro III (0,1) (nedan kallat Micro), tillåter odling EC i perfusion och stimulerande EC med olika cytokiner att framkalla protein uttryck. Dessutom odlade EC, rekombinanta proteiner som E-och P-selektin kan beläggas på mikros och interaktion med tumörceller kan observeras under laminära flödesförhållanden 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund av det låga antalet CTCs bland blodceller, är det svårt att isolera CTCs som en ren population av celler. För att studera CTC / EC interaktioner, den sällsynta och orena befolkning CTCs medför två stora utmaningar: a) Identifiering av CTCs bland blodceller; b) Observation av CTC / EG-interaktioner.
För att övervinna den första begränsningen att identifiera prostata CTCs bland blodkroppar, tog vi fördel av det faktum att nästan alla prostatat…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av medel från Department of Defense-Prostate Cancer Research Program (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 från National Cancer Institute, och Robert McCooey Genitourinary Oncology Research Fund. Vi vill tacka Dr Annarita Lorenzo (Institutionen för patologi) för att tillhandahålla VE-cadherin-antikroppar, och Dr Marco Seandel (Institutionen för kirurgi) för att ge HUVECs.
Materials
| Microslide | Ibidi | 80331 | |
| Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Plastic tubing | Tygon | AAQ04103 | |
| Male luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Female luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Syringe pump | Chemyx Inc | Fusion 100 | |
| Luer-lock syringe | BD Biosciences | 309628 | |
| M199 medium | Sigma | M7653 | |
| Endothelial Mitogen | Biomedical Technologies | BT-203 | |
| HBSS | Sigma | H9269 | |
| Anti-PSMA J591-488 | Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology | ||
| Interleukin-1 beta | Peprotech | 200-01B | |
| Trypsin | Millipore | SM-2002-C | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| HUVECs | Weill Cornell Medical College-Department of Surgery | provided by Marco Seandel | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-5648 | |
| 10x objective | Zeiss Plan Neofluar | ||
| Enzyme free cell dissociation reagent | Millipore | S-004-C | |
| RPMI-1640 | Lonza | 12-702-F | |
| Ficoll-paque plus | GE healthcare | 17-1440-02 |
Riferimenti
- Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
- Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer. Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).
- Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).
- Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis. Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).
- Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer. Cancer Res. , (2013).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).
- Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers. Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J Vis Exp. 24, (2009).
- Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp–/rag2– mice. Gut. 62 (5), 741-750 (2013).
- Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).
- Remuzzi, A., Giavazzi, R., Dejana, E., Corada, M. Adhesion of tumor cells under flow. Adhesion Protein Protocols. 96, 153-157 (1999).
- Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium. Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).
- Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development. Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).
- Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion. Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).
- Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).
