In vitro metode for å observere E-selektin-medierte interaksjoner mellom Prostata sirkulerende tumorceller stammer fra pasienter og humane endotelceller

Summary

Vår rapport beskriver en unik metode for å visualisere og analysere CTC / EF interaksjoner i prostatakreft under fysiologiske strømningsforhold.

Abstract

Metastase er en prosess hvor tumorceller skur fra den primære tumor intravasate blod vaskulære og lymfatiske system, og dermed få tilgang til extravasate og danne en sekundær nisje. Den ekstravasering av tumorceller fra blod karsystemet kan studeres ved hjelp av endotelceller (ECS) og tumor celler oppnådd fra forskjellige cellelinjer. Innledende studier ble utført ved bruk av statiske forhold, men det har vært godt dokumentert at egenkapitalbevis oppfører seg annerledes under fysiologiske strømningsforhold. Derfor er forskjellige flyt kammer forsamlinger tiden blir brukt til å studere kreft celle interaksjoner med egenkapitalbevis. Nåværende flyt kammer forsamlinger tilbyr reproduserbare resultater ved hjelp av enten ulike cellelinjer eller væske ved ulike skjær stress forhold. Imidlertid, for å observere og studere interaksjoner med sjeldne celler slik som sirkulerende tumorceller (CTCS), er visse endringer som kreves for å gjøres til den konvensjonelle strømningskammermontasjen. CTCser et sjeldent cellepopulasjon blant millioner av blodceller. Følgelig er det vanskelig å oppnå en ren populasjon av CTCs. Forurensning av CTCs med ulike typer celler som normalt finnes i sirkulasjon er uunngåelig hjelp stede berikelse eller uttømming teknikker. I denne rapporten beskriver vi en unik metode for å fluorescently label sirkulerende prostatakreftceller og studere deres interaksjon med egenkapitalbevis i en egenmontert flyt kammer system. Denne teknikken kan bli ytterligere anvendt for å observere interaksjonene mellom prostata CTCs og en hvilken som helst protein av interesse.

Introduction

Metastasering er en kompleks prosess i flere trinn som fortsatt dårlig forstått. Den E-selectin/selectin ligand akse har vist seg å spille en viktig rolle i tumormetastase ved å fremme primære klebe interaksjoner mellom det vaskulære endotel og cancerceller ^1,2. Endotelial (E)-selektin er et transmembrant protein uttrykt av aktiverte endotelceller, mens forskjellige E-selektin-ligand (er) er uttrykt ved tumorceller ^3. Tallrike in vitro tilnærminger har blitt ansatt for å modellere E-selectin/selectin ligand interaksjoner mellom kreftceller og endotelceller (ECS) ^en. Å studere disse interaksjoner, er forskjellige flyt kammersystemer blir ansatt til å simulere blod karsystemet. Blant strømningskammersammenstillinger, er parallell-plate gjennomstrømningskammeret (PPFC) i forbindelse med EKB rutinemessig brukt som en in vitro-modell som simulerer in vivo skjærspenningsbetingelser. I dennefremgangsmåte, EKB er dyrket på en 35-mm fatet og etter å ha oppnådd et monosjikt, er EKB festet til PPFC og skjærspenning basert eksperimenter utføres.

Men PPFC og andre aktuelle systemer presentere mange begrensninger å studere selvklebende interaksjoner mellom sirkulerende tumorceller (CTCs) stammer fra pasienter og egenkapitalbevis, først og fremst, fordi CTCs er en sjelden populasjon av celler, kaster fra den primære svulsten, sirkulerte blant millioner av blodceller (1 CTC per 10 ⁹ blodceller) ^4.. Derfor, i motsetning til ubegrenset tilførsel av dyrkede cellelinjer, lave CTC teller føre til svært få og sjeldne CTC / EC interaksjoner, som krever skikkelig flyt kanalbredde for å registrere interaksjoner for avspilling analyse. I tillegg, siden pasient avledet CTCs er en uren befolkning, derfor et identifikasjonsmerke er nødvendig for å spore CTCs i spesifikke. For å løse dette problemet, har vi utviklet en ny metode for å identifisere prostatakreft (PCA) CTCs ved å utnytte det faktum at nesten alle disse CTCs uttrykke prostata spesifikt membran antigen (PSMA) på deres celleoverflaten ^5,6. I denne rapporten har vi brukt prostatakreft cellelinje, MDA PCa2b (MDA), for å demonstrere den potensielle nytten av vårt nye system for å studere prostata CTC interaksjoner med egenkapitalbevis, slutt å forstå mekanismen for metastasering.

Vår metodikk kan brukes for ulike skjær baserte forsøk simulerer in vivo karsystemet ^7-9. Foruten å undersøke PCA CTC / EC-interaksjoner, kan den aktuelle strømningskammeret systemet lett tilpasses for analyse av perifert blod mononukleære celler eller tumorceller 'interaksjoner med ECS. Den enkle demontering og remontering av flyten kammer, en microslide III ^(0,1) (heretter omtalt som microslide), tillater dyrking egenkapitalbevis i henhold perfusjon og stimulere egenkapitalbevis med ulike cytokiner å indusere protein uttrykk. Dessuten, kultivert EKB, rekombinante proteiner slik som E-og P-selectin kan være belagt på microslide og vekselvirkning med tumorceller kan observeres i henhold laminære strømningsforhold ^10.

Protocol

En. Culturing HUVECs på Microslides for Observing CTC-endothelial Interactions Under panseret vev kultur, først skylle microslide, kanalbredde på 1 mm med PBS. Forsiktig belegge microslide med 200 pl av 50 pg / ml fibronectin (oppløst i PBS) under anvendelse av en 1 ml-Luer-lock sprøyte. Dekk microslide med lokket, og holder det inne i vevskultur hette i 30 minutter. Langsom dispensering av væsken i microslide hindrer dannelse av bobler i kanalen. Perfuse 200 ul varm (37 ° C) HUVEC …

Representative Results

Figur 1 viser en O / N kultur av en monolayer av egenkapitalbevis på microslide. De glødeskall på Figur 1a viser at 100% av microslide er synlig ved 5X objektiv mens 70% er synlig ved hjelp av en 10X objektiv (Figur 1B). For E-selektin-medierte interaksjoner, er celler rullende ved kantene ikke betraktet som gjør mer enn 70% av den microslide tilgjengelig for video-opptak og avspilling analyse. I vår erfaring, først dette oppsettet monteringen krever litt øvelse …

Discussion

På grunn av det lave antallet CTCs blant blodceller, er det vanskelig å isolere CTCs som en ren populasjon av celler. For å studere CTC / EC interaksjoner, utgjør den sjeldne og uren befolkning på CTCs to store utfordringer: a) Identifikasjon av CTCs blant blodceller; b) Observasjon av CTC / EF interaksjoner.

For å overvinne den første begrensning identifisere prostata CTCs blant blodceller, vi tok fordel av det faktum at nesten alle prostata kreftceller ut…

Materials

Microslide	Ibidi	80331
Fibronectin	Millipore	FC010
Plastic tubing	Tygon	AAQ04103
Male luer adapter	GlycoTech	31-001
Female luer adapter	GlycoTech	31-001
Syringe pump	Chemyx Inc	Fusion 100
Luer-lock syringe	BD Biosciences	309628
M199 medium	Sigma	M7653
Endothelial Mitogen	Biomedical Technologies	BT-203
HBSS	Sigma	H9269
Anti-PSMA J591-488	Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology
Interleukin-1 beta	Peprotech	200-01B
Trypsin	Millipore	SM-2002-C
Heparin	Sigma	H-3149
HUVECs	Weill Cornell Medical College-Department of Surgery		provided by Marco Seandel
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-5648
10x objective	Zeiss Plan Neofluar
Enzyme free cell dissociation reagent	Millipore	S-004-C
RPMI-1640	Lonza	12-702-F
Ficoll-paque plus	GE healthcare	17-1440-02