Método in vitro para observar interações E-selectina mediadas entre próstata células tumorais circulantes derivadas de pacientes e células endoteliais humanas
Summary
O nosso relatório descreve um método único para visualizar e analisar as interações CTC / CE no câncer de próstata em condições de fluxo fisiológicos.
Abstract
A metástase é um processo em que as células tumorais derramado a partir do tumor primário intravasate vascular arterial e do sistema linfático, assim, ganhar acesso ao extravasamento e formar um nicho secundário. A extravasão de células de tumor a partir do sistema vascular de sangue podem ser estudados utilizando células endoteliais (ECs) e as células tumorais obtidas a partir de diferentes linhas celulares. Os estudos iniciais foram realizados usando condições estáticas, mas tem sido bem documentado que os CEs se comportar de forma diferente sob condições de fluxo fisiológico. Portanto, diferentes conjuntos de câmara de fluxo estão sendo usados para estudar as interações de células de câncer com ECs. Montagens atuais câmara de fluxo oferecem resultados reproduzíveis, seja através de diferentes linhagens celulares ou fluidos em diferentes condições de estresse de cisalhamento. No entanto, para observar e estudar as interações com células raras, tais como células tumorais (CTCs) circulando, algumas alterações são necessárias a serem feitas para a montagem de câmara de fluxo convencional. CTCssão uma população de células raras entre os milhões de células sanguíneas. Por conseguinte, é difícil a obtenção de uma população pura do CTC. Contaminação de CTCs com diferentes tipos de células normalmente encontradas na circulação é inevitável o uso presente enriquecimento ou técnicas de depleção. No presente relatório, nós descrevemos um método único para rótulo circulando células cancerosas da próstata fluorescente e estudar as suas interacções com os ECs em um sistema de câmara de fluxo auto-montados. Esta técnica pode ser aplicada ainda para observar as interações entre CTCs próstata e qualquer proteína de interesse.
Introduction
A metástase é um processo multi-passo complexo que permanece pouco compreendido. O eixo ligando E-selectin/selectin tem mostrado desempenhar um papel importante na metástase de tumores através da promoção de interacções adesivas primárias entre o endotélio vascular e nas células cancerosas 1,2. Endotelial (E)-selectina é uma proteína transmembranar expressa por células endoteliais activadas, enquanto ligando diferente (s) de E-selectina é expressa por células de tumor 3. Numerosas abordagens in vitro têm sido utilizados com sucesso para modelar as interacções ligando E-selectin/selectin entre células tumorais e células endoteliais (ECs) 1. Para estudar essas interações, diferentes sistemas de câmara de fluxo estão sendo empregados para simular sistema vascular sanguíneo. Entre os conjuntos de câmara de fluxo, o fluxo de placas paralelas câmara (PPFC) em conjunto com ECs é rotineiramente utilizado como um modelo in vitro simulando em condições de estresse de cisalhamento in vivo. Nestemétodo, ECs são cultivadas numa placa de 35 mm e depois de atingir uma monocamada, ECs estão ligados ao PPFC e experiências baseadas tensão de cisalhamento são executados.
No entanto, PPFC e outros sistemas actuais apresentam muitas limitações para estudar as interacções adesivas entre as células tumorais (CTCs) derivadas de doentes e CEs, circula principalmente, porque CTC são uma população rara de células, verter a partir do tumor primário, que circula entre os milhões de células sanguíneas (1 CTC 10 9 por células do sangue) 4. Assim, ao contrário de oferta ilimitada de linhas de células cultivadas, baixa contagem CTC levar para muito poucos e raros interações CTC / CE, requerendo a largura do canal fluxo adequado para gravar as interações para análise de reprodução. Além disso, uma vez que pacientes CTC derivados são uma população impuro, portanto, um marcador de identificação é necessária para controlar CTC em específico. Para resolver este problema, foi desenvolvido um novo método para identificar o câncer de próstata (CaP) CTCs tirando partido do facto de que praticamente todos estes CTC expressam antigénio de membrana específico da próstata (PSMA) na sua superfície celular 5,6. Neste relatório, foi utilizada a linha de células de câncer de próstata, MDA PCa2b (MDA), para demonstrar a utilidade potencial do nosso novo sistema para estudar as interações de próstata CTC com ECs, eventualmente, para entender o mecanismo de metástases.
Nossa metodologia pode ser aplicada para vários experimentos de corte com base em simulação de sistema vivo vascular 7-9. Além de examinar as interações PCa CTC / CE, o atual sistema de câmara de fluxo pode ser facilmente adaptado para a análise de células mononucleares do sangue periférico ou células tumorais interações 'com ECs. A facilidade de desmontagem e remontagem da câmara de fluxo, um MicroSlide III (0,1) (doravante referida como MicroSlide), permite a cultura ECs sob perfusão e estimulando ECs com diferentes citocinas para induzir protein expressão. Além disso, em cultura células endoteliais, as proteínas recombinantes, tais como a L-e P-selectina podem ser revestidos na microlâmina e interacções com as células tumorais podem ser observados sob condições de escoamento laminar 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Devido ao baixo número de CTCs entre as células do sangue, é difícil isolar CTCs como uma população pura de células. Para estudar interações CTC / CE, a população rara e impura de CTCs coloca dois desafios principais: a) Identificação de CTCs entre as células do sangue; b) Observação de interações CTC / CE.
Para superar a primeira limitação de identificar CTCs próstata entre as células do sangue, aproveitamos o fato de que praticamente todas …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por financiamento do Departamento de Defesa, da próstata Cancer Research Program (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 do Instituto Nacional do Câncer, ea McCooey geniturinário Fundo de Investigação Oncológica Robert. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Annarita Lorenzo (Departamento de Patologia) para a prestação de anticorpos VE-caderina, e Dr. Marco Seandel (Departamento de Cirurgia) para a prestação de HUVECs.
Materials
| Microslide | Ibidi | 80331 | |
| Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Plastic tubing | Tygon | AAQ04103 | |
| Male luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Female luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Syringe pump | Chemyx Inc | Fusion 100 | |
| Luer-lock syringe | BD Biosciences | 309628 | |
| M199 medium | Sigma | M7653 | |
| Endothelial Mitogen | Biomedical Technologies | BT-203 | |
| HBSS | Sigma | H9269 | |
| Anti-PSMA J591-488 | Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology | ||
| Interleukin-1 beta | Peprotech | 200-01B | |
| Trypsin | Millipore | SM-2002-C | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| HUVECs | Weill Cornell Medical College-Department of Surgery | provided by Marco Seandel | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-5648 | |
| 10x objective | Zeiss Plan Neofluar | ||
| Enzyme free cell dissociation reagent | Millipore | S-004-C | |
| RPMI-1640 | Lonza | 12-702-F | |
| Ficoll-paque plus | GE healthcare | 17-1440-02 |
Riferimenti
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