En mikrofluid Technique å sondere Cell Fleksibilitet
Summary
Vi demonstrerer en MicroFluidics-baserte analysen for å måle tidsskalaen for celler til transitt gjennom en sekvens av mikron-skala restriksjonar.
Abstract
Her har vi detalj utforming, fabrikasjon og bruk av en mikrofluid enhet for å evaluere deformerbarhet av et stort antall enkeltceller på en effektiv måte. Vanligvis kan data for ~ 10 2 celler kan erverves i løpet av en 1-timers eksperimentet. En automatisert bildeanalyse-program gjør det mulig effektiv etter eksperiment analyse av bildedata, slik prosessering for å være fullstendig i løpet av få timer. Vår geometri enheten er unik ved at cellene må deformeres gjennom en serie av mikron-skala innsnevringer, og dermed muliggjør den innledende deformasjon og tidsavhengig avslapning av individuelle celler som skal undersøkes. Anvendeligheten av denne metode til human promyelocytiske leukemi (HL-60)-celler er vist. Kjøring celler til å deformere gjennom mikron-skala restriksjonar ved hjelp trykkraft, observerer vi at menneskelig Promyelocytic (HL-60) celler øyeblikk occlude den første innsnevring for en median tid på 9,3 msek før passering raskere gjennom den påfølgende constrictioner med en median overføringstiden av 4,0 ms pr innsnevring. I motsetning til dette, all-trans retinsyre-behandlet (nøytrofil-type) HL-60-celler som okkluderer den første innsnevring i bare 4,3 ms før passering gjennom de etterfølgende innsnevringer med en midlere transittid på 3,3 msek. Denne metoden kan gi innsikt i viskoelastisk natur celler, og til slutt avdekke molekylære opprinnelsen til denne atferden.
Introduction
Endringer i celleform er avgjørende i en rekke biologiske sammenhenger. For eksempel, erytrocytter og leukocytter deformeres gjennom kapillærer som er mindre enn sin egen diameter 1. I metastasering, må kreftceller deformert gjennom trange interstitiell hull samt kronglete blodkar og lymfekar nettverk til frø på sekundære områder to. Å sondere den fysiske oppførselen til enkeltceller, presentere microfluidic enheter en ideell plattform som kan tilpasses til å studere en rekke celle atferd inkludert deres evne til å migrere gjennom smale hull 3 og passivt deformeres gjennom mikron-skala constrictions 3- ni. Polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic enheter er optisk transparent, slik at celle deformasjoner å bli visualisert ved hjelp av lysmikroskopi og analysert ved hjelp av grunnleggende bildebehandlingsverktøy. Videre kan sammensetninger av innsnevringer bli nøyaktig definert, slik at analyse av flere celler samtidig med engjennomstrømming som overgår mange eksisterende teknikker 10,11.
Her presenterer vi en detaljert forsøksprotokoll for sondering celle formbarhet ved hjelp av "Cell Deformer 'PDMS microfluidic enhet. Anordningen er utformet slik at cellene passasje gjennom sekvensielle innsnevringer; denne geometri er vanlig i fysiologiske sammenhenger, som for eksempel lunge-kapillære bed 12. For å måle celle deformerbarhet, gir transittid en enkel beregning som er lett måles som den tid som kreves for en enkelt celle til transitt gjennom en enkelt innsnevring 4,6. For å opprettholde et konstant trykkfall over de innsnevrede kanaler under celle transitt, bruker vi trykkraft. Vår protokoll omfatter detaljerte instruksjoner om enheten konstruksjon og fabrikasjon, betjeningen av trykkraft, preparering og avbildning av celler, så vel som bildebehandling for å måle tid for cellene til å deformeres gjennom en rekke innsnevringer. Vi inkludererbåde enhets design og visjon databehandling kode som supplerende filer. Som et representativt utvalg av data, viser vi celletransittiden gjennom en rekke innsnevringer som en funksjon av antall innsnevringer passaged. Analyse av tidsskalaen for celler til transitt skjønt trange innsnevringer av en mikrofluidteknisk enhet kan vise forskjeller i deformasjon av en rekke celletyper 4,5,13. Anordningen vist her entydig undersøkelser celle transitt gjennom en serie av mikron-skala innsnevringer; dette designet emulerer kronglete sti som cellene opplever i omløp og også gjør sondering flere fysiske egenskapene til cellene som avslapping tid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her gir vi en omfattende eksperimentell prosedyre for å analysere deformasjon av celler i transitt gjennom snørt microfluidic kanaler ved hjelp av trykkraft. En MATLAB script muliggjør automatisert databehandling (Supplemental Material); en oppdatert versjon av koden er opprettholdt ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). I videre forstand kan de teknikker som er presentert her tilpasses i mange cellebaserte assays microfluidic, herunder virkningen av cytoske…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Lloyd Ung for konstruktive innspill i tidlige versjoner av denne teknikken, Dr. Jeremy Agresti for trykklokket design tips, og Dr. Ping Qi for hans hjelp i fabrikasjon trykklokket. Vi er takknemlige for laboratorier av M. Teitell og P. Gunaratne for å gi en rekke celleprøver for testing. Vi er takknemlige for National Science Foundation (KARRIERE Award DBI-1254185), UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, og UCLA Clinical og Translasjonell Science Institute for å støtte dette arbeidet.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant | Fisher Scientific | 8409400 | Produced by BASF, also available through Sigma |
| PDMS base and crosslinker | Essex Brownell | DC-184-1.1 | Product commonly named Sylgard 184 Elastomer |
| Oxygen plasma discharge unit | Enercon | Dyne-A-Mite 3D Treater | |
| Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Fingertight Ferrule, 1/32" | Upchurch Scientific | UP-F-113 | |
| Fingertight III Fitting, 10-32 | Upchurch Scientific | UP-F-300X | |
| polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm | Valco | TPK.515-25M | |
| polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm | Becton Dickinson | 427406 | |
| Pressure regulator | Airgas or Praxair | ||
| Polyurethane tubing, 5/32” OD | McMaster Carr | 5648K284 | |
| Push-to-connect fittings | McMaster Carr | 5111K91 | |
| Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter | Omega | IP413-020 | |
| 16-bit,250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ | National Instruments | NI PCI 6225-779295-01 | |
| Analog Connector Block-Screw Terminal | National Instruments | SCB-68-776844-01 | |
| LabView System Design Software | National Instruments | ||
| Matlab Software | The MathWorks, Inc. | Matlab R2012a | Code requires the Image Processing Toolbox |
| Shielded Cable | National Instruments | SHC68-68 |
Riferimenti
- Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung. Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil’ hypothesis revisited. Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).
- Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. Deformability study of breast cancer cells using microfluidics. Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).
- Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).
- Chen, J., et al. Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells. Lab on a Chip. 11 (18), 3174 (2011).
- Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. High-throughput biophysical measurement of human red blood cells. Lab on a Chip. 12 (14), 2560 (2012).
- Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device. Lab on a Chip. 13 (16), 3275 (2013).
- Hogg, J. C. Neutrophil kinetics and lung injury. Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
- Yap, B., Kamm, R. D. Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels. Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).
- Bow, H., et al. A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria. Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).
- Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).
- Doll, J. C., et al. SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements. Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).
- Huntington, M. D., Odom, T. W. A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source. Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).
- Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns. Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).
- Rowat, A. C., Weitz, D. A. Chips & Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device. Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).
- Meyer, P., Kleinschnitz, C. Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells. Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).
- Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization. Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability . Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
- Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO. Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).
- Rowat, A. C., et al. Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions. Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).
- Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness. Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
