Manyetik cımbız, güçlü bir tek moleküllü manipülasyon teknikleri, biyolojik makromoleküllerin (manyetik bir tork cımbız olarak adlandırılan bir konfigürasyonu kullanılarak) ve tork (manyetik cımbız serbestçe yörüngeli adı konfigürasyonu kullanılarak) bükümün doğrudan ölçümleri için uyarlanabilir. Bu tür ölçümler yapmak için rehber DNA ve ilgili nükleotid protein filamanların çalışma uygulamaları da dahil olmak üzere verilmiştir.
Tek moleküllü teknikleri mümkün gerçek zamanlı olarak çözelti içinde tek tek biyolojik moleküllerin davranışını incelemek için tercih. Bu teknikler atomik kuvvet mikroskobu olarak adlandırılan kuvvet spektroskopisi yaklaşımları, optik cımbız, germe, akış ve manyetik cımbız bulunmaktadır. Bu yaklaşımlar arasında, manyetik cımbız sabit bir germe kuvveti muhafaza ederken, tork uygulamak için kabiliyetleri ile kendilerini seçkin. Burada, bu görüntülenmiştir örneğin, bir "geleneksel" manyetik cımbız deneysel yapılandırma, enine alanın büyüklüğünü en aza indirmek için alan konfigürasyonun basit tadilatı yoluyla, biyolojik bir molekül içinde bükümü derecesini ölçmek için adapte edilebilir. Edilen yapılandırma özgürce yörüngedeki manyetik cımbız denir. Buna ek olarak, bu alan konfigürasyonun başka değişiklik ve içinde arasında ara bir değeri olan bir enine alanı elde nasıl gösterilmektedir8220; geleneksel "manyetik cımbız ve mümkün doğrudan biyolojik molekül saklanan torkunu ölçmek için yapar özgürce yörüngesindeki manyetik cımbız,. Bu yapılandırma, manyetik momenti cımbız adlandırılır. Ekteki video özgürce yörüngesindeki manyetik cımbız ve manyetik tork cımbız içine konvansiyonel manyetik cımbız dönüşüm yapılabilir nasıl ayrıntılı olarak açıklar ve bu tekniklerin kullanımını gösterir. Büyük ölçüde bu güçlü aracın çok yönlülüğünü genişletilmesi sırasında bu uyarlamalar konvansiyonel manyetik cımbız tüm gücünü korumak.
Son yıllarda, tek bir molekül teknikleri kinetiği ve temel Mekanokimya fikir verecek, ilerleyici motor proteinlerinin ve diğer enzimlerin çalışmada, geniş uygulanabilirliği kanıtlamıştır. Kuvvet spektroskopisi bağlamında önemli katkılar atomik kuvvet mikroskobu germe akışı, optik ve manyetik cımbız tarafından yapılmıştır. Optik ve manyetik cımbız (MT) özellikle yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip molekül manipülasyon açısından büyük esneklik birleştirerek başardılar. Burada, bir yüzey ve süperparamanyetik boncuk 1-3 arasında gergin biyolojik moleküllerin hem germe kuvvetleri ve momentleri uygulayabileceğiniz, MT odaklanmak.
Manyetik cımbız (MT, Şekil 1a), mekanik, nükleik asitlerin özellikleri yanı sıra, proteinler ile etkileşimleri hem de izlemek için kullanılan bir çok ilginç bir tek moleküllü bir tekniktir. MT çok gücügenel basitlik ve sağlamlık deneysel uygulama, tork uyduruk uygulama, doğal çalışma ve sabit kuvvet modunda 4 basit kalibrasyon, ölçümleri 5, 6 paralel uzantısı ve numune ısıtma ve fotohasar yokluğu da dahil olmak üzere s. Diğer tek-molekül yaklaşımlar karşılaştırıldığında, MT ≈ 10 FN gibi düşük güçlerine güç-bağımlılık ölçümleri gerçekleştirmek ve sade bir dille süperburulma derecesini kontrol etmek yeteneğine sahip bir yol sağlar. MTS ağırlıklı olarak nükleik asitleri 7, 8 içeren biyolojik süreçleri araştırmak için deneysel araç olarak kullanılmış olsa da, aynı zamanda protein 9-13 ya da hücreler 10, 14-17 mekanik özelliklerinin çalışmalarda uygulama bulmuşlardır. Çok sayıda yararlı referanslar MT 4, 18-20 oluşturmak ve çalıştırmak için nasıl açıklamak olduğunu mevcuttur.
However, geleneksel MT onlar tork uygulamak iken, doğrudan tork ölçmek değil, doğrudan dönme hareketi izlemek ve yok. Buna ek olarak, nükleik asit şeridin serbest dönmesini sınırlamak. Burada, biz mıknatıs cımbız iki uzantıları mevcut. İlk olarak adlandırılan serbest yörüngeli manyetik cımbız (FOMT, Şekil 1b) 21 sağlar, ip ekseni etrafında dönme hareketini kısıtlayıcı olmayan denge açısı dalgalanmalar ve bağlı nükleik asit moleküllerinin büküm değişikliklerin ölçümleri. İkinci, manyetik tork cımbız tek biyomoleküllere 22-27 hem kuvvet ve tork uygulamak ve doğrudan ölçmek için yeteneğine sahiptir (MTT, Şekil 1c), olarak adlandırılan.
Aşağıdaki protokol, okuyucu onun / onu elden bir 'geleneksel' MT enstrüman anda sahip olduğunu tahmin. Biz oluşturmak ve çalıştırmak kurmak MT, hem de nasıl başvuruları için Tartışma okuyucu bakın consideManyetik boncuklar, mıknatıslar, ve izleme rutinleri seçiminde dikkate alınmalıdır oranlarını gösterir. Buna ek olarak, bölümler 1 ve Protokol Metin 2 biz genellikle hazırlamak ve MT kullanılmaya yönelik bir DNA örneği yanı sıra, geleneksel MT tek bir DNA üzerinde gerçekleştirilebilir, ön ölçümler inkübe açıklanmıştır. Protokol Metin Bölüm 3 ve 4 bir MT enstrüman kolayca adapte FOMT ve MTT ölçümler için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
MTT veya FOMT kullanarak deneyler çalıştırırken, seçimler bir numarası vb boncuk, mıknatıs, izleme protokolleri, yapılacak en iyi seçenek ilgi deney bağlıdır konusunda yapılması gerekmektedir. Aşağıda, belirli bir deney için seçimi kolaylaştırmak gereken, farklı seçimler eşlik dengeler açıklar. Sonra, MTT ve FOMT deneylerin uyum ve çalışan eşlik çeşitli kritik adımları anlatacağız. Son olarak, biz mevcut yöntemlere göre hem de gelecekteki uygulamaları ile MTT ve FOMT önemini tartışmak.
Önceki MTT ve FOMT Deneylerin Başlat Hususlar
Herhangi bir deneme kullanımı için manyetik boncuk bir türünü seçmek için birini gerektirir. Bir kaç piyasada bulunan streptavidin kaplı süperparamanyetik boncuklar, örneğin, 0.25 mikron yarıçapı boncuk, 0.5 mikron yarıçapı boncuk, veya 1.4 mikron yarıçapı boncuklar (ler arasında seçim yapabilirsiniz) malzemeleri tablo ee. Daha büyük taneleri (yaklaşık hacim olarak ölçekleme) daha küçük boncuklar ile karşılaştırıldığında, artan bir manyetik an olacaktır ve bu nedenle bunların kullanımı, daha yüksek kuvvetlerinin uygulanmasını kolaylaştıracak (eden araçlar sağlanmıştır tipik kuvvetleri için Tablo 1 'e bakınız). Işaretleyici boncuklar kullanılarak açısal izleme istendiği zaman, tipik olarak 1.4 mikron çapa sahip çalışma ve (karşılık gelen bağlanma protokolü için paragraf 1.9) işaret boncuklar olarak 0,5 um çapı manyetik olmayan bir biyotinile boncuk kullanır. Küçük boncuk kullanımı özellikle boncuk rotasyon τ için karakteristik zaman ölçeği olarak C gerçekten yay sabiti γ / k θ üzerinden sistemin sürükle oranına eşittir, FOMT için tavsiye edilir; önemlisi, ~ R boncuk 3, yani yarıçapının üçüncü gücü gibi açısal ölçüm zamanı gam hakkında dönme sürükleme katsayısı için (bkz. Tablo 2karakteristik zaman birkaç FOMT boncuk-DNA kombinasyonları ve MTT ölçümler) için ölçekler. Uygulanabilecek maksimum kuvvete eşlik eden azalmalar silindirik mıknatıslar 27 ters çevrilmiş bir yığın kullanılarak ele alınabilir. Bununla birlikte, FOMT ölçümlerde bazen en iyi elde zamansal çözünürlük ve maksimum uygulanan kuvvet arasında uyum sağlamak için gerekli olabilir.
Buna ek olarak, bir deney bir mıknatıs konfigürasyonun seçimi gerektirir. , Geleneksel manyetik cımbız konfigürasyonu (Şekil 1a) olarak, tipik olarak, 4 mıknatıslar arasında bir 0.5 veya 1 mm bir boşluk ile dikey olarak 5x5x5 mm kübik bir çift mıknatıs kullanın. Mıknatıslar x (y) ekseni boyunca aralanmıştır, bu esas olarak x (y) ekseni boyunca yönlendirilen bir manyetik alan oluşur. FOMT deneyler için, silindir şeklinde bir mıknatıs kimin merkez manyetik alan esas yöneliktir seçilirz ekseni boyunca (Şekil 1b). Uygulamada, 6 mm toplam kalınlık için, bu tür üç silindirik şekilli mıknatıslar, 6 mm çapında ve 2 mm çaplı bir merkezi deliği olan, her bir yığın kullanın. Daha yüksek çekme kuvvetleri arzu edildiği zaman, alt mıknatıs karşı manyetizasyon ile istiflenmiş edildiği bir "ters çevrilmiş yığın" mıknatıs konfigürasyonu tercih edilir. MTT konfigürasyonu (Şekil 1c) elde etmek için, biz, FOMT yapılandırma, 4 mm çaplı ve 7 mm yükseklikte tipik olarak, bir katı silindirin ana mıknatıs yığının tarafına ek bir mıknatıs ilave edin. Bizim araçların elde maksimal kuvvetleri mıknatıs yapılandırmaya bağlı görmek bkz. Tablo 1 için.
MTT ve FOMT Deneylerin Hizalama
Manyetik boncuklar (yaklaşık olarak) eşit işlevselleştirilmiş yüzeye sahip olduğu için (tipik olarak streptavidin) ile fonksiyonelleştirilmiş n her ikisinin de bağlanması bu yanaucleic asit bağlama elemanları, ve işaretleyici boncuk (durumda markör boncuk esaslı açısal izleme kullanılır) bağlayıcı ve / veya manyetik işaretleyici boncuk boncuk takmak burada çözelti içinde basit bir kuluçkalama ile, tek bir kontrol etmez oluşur. Manyetik boncuklar dış alanın yönü boyunca hizalamak eğilimi tercih edilen bir mıknatıslanma eksene sahiptir. Biz tercih mıknatıslanma ekseni kuzey ve güney kutupları olarak boncuk yüzeyini kesen kredi ifade, daha sonra DNA-bağlama ipi ekvatora yakın bağlı olduğu boncuklar yakın ya da hafif daha büyük bir çapa sahip dairesel bir halkaya üzerinden yazacaktır FOMT boncuk yarıçapı; aksine, güney kutbuna yakın bağlı boncuk Denklem 3-5 kullanılarak dairenin uydurma engel, hangi FOMT çok küçük yarıçaplı dairesel bir halkanın üzerinde dalgalanma olacaktır. Biz basit küresel geometri ile, ekvatora yakın bağlama olasılığı tam kutuplarda bir eki çok daha büyük olduğuna dikkat; Bu nedenle, en bEADS gergin olacak (x, y) dayalı açısal izleme başarılı bir şekilde gerçekleştirilebilir şekildedir.
Benzer bir tartışma referans işaretçi göre açısal takibi için markör boncukların bağlanması için de geçerlidir. Işaretleyici boncuk açısı izlemeyi sağlayan manyetik boncuk görüntüde bir asimetri oluşturmak için kullanılır. Işaretleyici boncuk boncuk (yani doğrudan üstünde veya altında) kuzey ya da güney kutbunda tam bağlıysa, çıkan görüntü yine rotasyona simetrik ve açısal izleme protokol başarısız olur. Ancak, aynı küresel geometri argüman tarafından, bir işaretleyici boncuk kutuplarından birinde doğrudan eklemek için şans nispeten küçük; pratikte en işaretleyici boncuk açısal izlemeyi etkinleştirmek için yeterli bir asimetri vermek bulabilirsiniz. Son olarak, geleneksel manyetik cımbız alan yönünde (x, y)-düzleminde olduğuna dikkat ediniz; bu nedenle, kordonun tercih edilen bir mıknatıslanma eksen th hizalanacaktıre (x, y)-düzlemi ve kuzey ve güney kutupları, yukarıda tanımlandığı gibi, kordonun kenarlarında olması muhtemel kutuplar üst ve alt kısmında FOMT veya MTT, durum. olacak
FOMT deneylerde, önemli bir adım, radyal manyetik alan boncuk yakınlık ihmal edilebilir olduğu şekilde silindirik mıknatısın hizalamasıdır. Bu uyum, bir seferde tek bir boncuk için yapılır. FOMT boncuk hareket eşit bir dairesel halkanın üzerinde dağıtılmış olup olmadığını yargıç için, ölçüm süresi 20 · τ C'yi aşmamalıdır. Τ C 8 kbp DNA ve 0.5 mm çapında boncuk için ~ 45 sn eşit olarak, ölçüm süresi uyum son aşamalarında ~ 900 sn. 1.9 kbp DNA karşılaştırılması, kullanımı ve 0.25 mm çapında boncuklar için τ C yirmi katlık bir ~ 2 saniye (ayrıca tablo 2'yi görünüz) azaltır.
F sırasında Takip için Kritik Adımlar ve DüşüncelerOMT ve MTT Deneyleri
Boncuk düzlem dalgalanmaları izlemek için, onun (x, y)-konumunda, yani, daha sonra biz zaman aralıkları 35, 36 bir boncuk tarafından görüntülenen yoğunluk profilleri bir çapraz-bağıntı analizi kullanılabilir. Bu birkaç nanometre 20 bir doğruluk alt-piksel çözünürlükte yapılabilir. Z boncuk hareketi izlemek için, tipik olarak, nükleik asit, 20 bağlı olan boncuk kırılma halkaları görüntüleme sırasında amacı, odak düzlemi (OFP) doğru dikey yönde kaydırılır, burada ilk olarak, Gosse ve Kroket tarafından tasarlanan bir yöntem kullanınız . Bu şekilde, bir kalibrasyon profil çubuk ile OFP 19 arasındaki mesafeye göre boncuğun kırılma motifi arasında ilişki üretilir. Bu kalibrasyon profili interpolasyon zaman, boncuk, dikey yer değiştirmeler de birkaç nm, 20 kadar bir hassasiyetle ölçülebilir.Biz daha rafine izleme algoritmaları 37, 38 yanı sıra birden fazla boncuk 5, 6, 37 izleme paralel uygulamalarını açıklayan ek başvurular okuyucu bakın.
Açısal koordinatlara (x, y)-pozisyonların dönüşüm dayanır açısal izlemeyi kullanırken, biz şöyle devam tavsiye. Boncuk kullanmak, dairesel bir halkasını dışarı izleri hangi bir zaman izlemesi (x i, y i) pozisyonları (ben nerede sonraki ölçüm noktaları gösterir indeks) daire merkezini (x 0, y 0) ve yarıçapı R daire sığacak en aza indirerek (Şekil 2a):
(3)
toplamı tüm veri noktaları üzerinde çalışır nerede. Fitti sonrang x 0, y 0 ve R daire kullanarak zaman iz her veri noktasının kutupsal koordinatları (r i, θ i) belirler:
(4)
(5)
Bir fazlı ± bir atlayış π uygun durumlarda eklemek için, yani açı θ "açmak" için bakmak gerektiğini unutmayın. (R, θ) koordinatları (x, y) montaj ve dönüşüm için özel yazılmış kod istek üzerine yazarların edinilebilir. FOMT olarak, boncuk bir dairevi çark üzerinden izler iz hangi bir zaman hizalama kaba (bakınız adım 3.3) sağlanması ve boncuk termal dalgalanmaları kayıt ile elde edilebilir. MTT, termal olarak fluctuations dairevi çark dışarı iz yetersiz; Bunun yerine, Denklemler 3-5 kullanarak daire sığacak şekilde birkaç tur döndürülür mıknatıslar (genellikle 0.1 Hz) yavaş yavaş olan bir zaman iz kullanın.
Biz, (MTT için, bu açısal izleme işaretleyici (Şekil 1 c, Şekil 1d, Şekil 3a) ile veya açısal koordinatları halinde (x, y)-pozisyonların dönüşüm yoluyla, yani uygun bir açısal izleme yaklaşımı, seçim için önemli olduğuna dikkat Şekil 1d, Şekil 2b). Tipik olarak (x, y)-pozisyonları ve işaretleyici boncuk kullanımından açısal izleme doğruluk karşılaştırılabilir iken, tarif edildiği gibi bu çapraz-karışma, (x, y) ve açısında bir boncuk dalgalanmalar arasında meydana gerçekleştirmek için önemlidir Janssen ve diğerleri 32: Bu şekilde, (x, y)-pozisyonlarından açısal izleme Resim geçerli olduğu (x Brownian dalgalanmalar, Y) koordinat açısal belirsizlik ve (x, y) izleme yan mıknatısın konumunun ayarlanması ile dönme tuzak sertliğinin ayarlama gerektirebilir onun doğru kullanımı için sadece önemsiz ölçüde katkıda bulunur. Tipik olarak, daha yüksek sertlik tuzak kullanılmasıdır işaretleyici boncuklar kullanılarak açısal takip kullanımını gerektirir. Işaretleyici boncuk kullanılması (aşama 1.9 'de bağlanma protokolü) kullanılabilir iplerini sayısını azaltabilir bir başka ek bir adım gerektirir. Işaretleyici boncuk-tabanlı izleme kullanırken, bir işaretleyici boncuk iyi sonuçlar için ekvatora yakın bağlı olan manyetik boncuk seçmek önemlidir.
FOMT ve MTT Önemi Mevcut Yöntemleri ve Uygulamaları karşılaştırıldığında Yaklaşımlar
Yukarıda, kolaylıkla MTT veya FOMT içine aleti dönüştürmek için mıknatıs yapılandırmaları ve değişiklikler, bir geleneksel MT başlangıç nasıl göstermiştir. Bu basit modification, bir açısal izleme marker kullanımı istenen açısal izleme giriş eşlik edilebilir, bu bağlı olarak, tork uygulamak tork ölçmek veya büküm ölçmek için kullanıcıya izin verir gibi, her iki yapılandırmaları derhal bir güçlü noktası eldeki deneme. Giriş kısmında belirtildiği gibi, FOMT ve aynı zamanda paralel ölçümler 5 yeteneği yararlanan özellikle de MTT ile, özellikle sadeliği, MT mevcut güçlü birçok ikinci MTT yarar her ikisi de 6 (verilen bu kadar kolay FOMT elde değildir silindirik mıknatısın merkezi ile ilgili olarak şeridin hizalanma gerekliliği). Özellikle, MTT ve FOMT diğer tekniklerle, özel olarak imal edilmiş nano-parçacıklar 22, 39, 40, karmaşık bir optik tasarım 41, ya da gergin içinde ek boncuk tanıtımı (DNA) molekülü, 42 aksine, gerektirmez. O Bu türorada teknikler de bu tür daha yüksek zamansal çözünürlüğü 27, 43, 44 gibi başka avantajlar sağlayabilir. DNA moleküler motorların davranışı hem de etkilenir ve yerel büküm ve tork için sonuçlara sahip olarak FOMT MTT ve her ikisi de, genom işleme çalışmaya gelecek uygulamalar bulmak gerekmektedir. Ek uygulamalar DNA nanoteknoloji 27 çıkan alanında veya biyolojik işleme 7, 45 aktif döner motorların daha geniş bir alan bulunabilir.
M270 (R boncuk = 1.4 um) | Myone (R boncuk = 0.5 um) | ADEMTECH (R boncuk = 0.25 um) | |
Konvansiyonel MT (kübik 5 x 5 x 5 mm 3 mıknatıs çifti, 1 mm boşluk, dikey hizalama) | 70 pN | 8 pN | 1.6 pN |
FOMT veya MTT * (üç silindirik mıknatıslar yığını, 6 mm çaplı, 2 mm çaplı boşluk) | 9 pN | 1 pN | 0.2 pN |
FOMT veya MTT * (üç silindirik mıknatıslar yığını, 6 mm çapında, 1 mm çaplı boşluk) | 18 pN | 2 pN | 0.4 pN |
FOMT veya MTT * (sonuncusu üç silindirik mıknatıslar yığını saygısız, çapı 1 mm boşluk) | ~ 50 pN | 9 pN | 1.8 pN |
* MTT küçük yan mıknatısın varlığı germe kuvveti üzerinde önemsiz bir etkiye sahip
Tablo 1. Maksimum kuvvetler tipik olarak farklı mıknatıs konfigürasyonları ve boncuk türleri için elde etti.
R boncuk = 1.4 um | R boncuk = 0.5 um | R boncuk =0.25 mikron | |
Sürtünme katsayısı * | 120 pN · nm · sn | 5.5 pN · nm · sn | 0.7 pN · nm · sn |
Karakteristik zaman ölçeği: FOMT, 10 kbp'lik DNA ** | 1200 san | 55 sn | 7 sn |
Karakteristik zaman ölçeği: FOMT, 1 kbp'lik DNA | 120 sn | 5.5 sn | 0.7 sn |
Karakteristik zaman ölçeği: MTT, k, q = 100 pN · nm / rad | 1.2 sn | 0.06 sn | 0.007 sn |
Karakteristik zaman ölçeği: MTT, k q = 1000 pN · nm / rad | 0.12 sn | 0.006 sn = 6 milisaniye | 0.0007 s = 0.7 msn |
* "Ekvator" aracılığıyla bir eksen etrafında dönmek için sürtünme katsayısı (Şekil 1b de gösterildiği gibi bir durum, yani), 14 ile verilen p · · s · s tampon viskozitesidir R boncuk 3,.
** FOMT olarak, dönme tuzak sertlik DNA burulma sertliği, k, q ile verilir, DNA = C · C, etkin burulma kalıcılık uzunluğudur k B T / L C, (burada 80 nm olduğu varsayılmıştır bir ara kuvvet rejimi, F ~ 1 pN edilmiş) ve L C karakteristik olan DNA, baz çifti başına 0.34 nm kontur uzunluğudur.
Tablo 2.. Sürtünme katsayıları ve karakteristik zaman FOMT ve MTT için ölçekler.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma TU Delft, Bilimsel Araştırma Hollanda Örgütü (NWO), Maddenin üzerine Temel Araştırma Vakfı ve Avrupa Bilim Vakfı tarafından desteklenen oldu.
Sandblaster | Great Lake Orthodontics | 190-070 Microetcher II | |
Nitrocellulose | Life Technologies | LC2001 | |
Magnetic particle concentrator | Life Technologies | 12002D | |
Non-magnetic latex beads (0.5 μm radius) | Polysciences | 17010 | |
Non-magnetic latex beads (1.5 μm radius) | Sanbio | PV05N/2179 | |
Antidigoxigenin | Roche | 11 214 667 001 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.25 μm radius) | Ademtech | 3150 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.5 μm radius, “MyOne”) | Life Technologies | 650.01 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (1.4 μm radius, “M270”) | Life Technologies | 653.05 | |
Biotin-coated latex beads (0.5 μm radius) | Life Technologies | F-8768 | |
Cubic magnets for conventional tweezers | Supermagnete | W-05-N50-G | |
Cylindrical magnet for MTT and FOMT | Supermagnete | R-06-02-02G | |
Side magnet for MTT | Supermagnete | S-04-07-N | |
Linear stage | Physik Instrumente | M-126.PD | |
Rotary stage | Physik Instrumente | C-150 | |
High-resolution automated sample stage | Physik Instrumente | P-733.2D | |
Software for coding analysis routines | The Mathworks | Matlab | custom-written routines are available from the authors |