Электропрядения фактор роста Освобождение микросфер в волокнистых Строительные леса
Summary
This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.
Abstract
This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.
Introduction
Один из текущих проблем в нервной тканевой инженерии является создание нерва канал (NC), который имитирует внеклеточного матрикса, где нервы расти естественным образом. Исследования показали, что клетки реагируют на нескольких факторов, в их среде, включая механическое, топографических, клея и химических сигналов 1-3. Одной из основных проблем в этой области состоит в определении соответствующую комбинацию сигналов и изготовления систему, которая может поддерживать сигналы в течение длительного периода, чтобы поддерживать рост клеток 4. Периферические нейроны, как известно, предпочитают мягкую подложку, быть направлены на выровненных волокон и отвечать фактора роста нервов (NGF) 5-7. НК, который может обеспечить химические сигналы, в течение нескольких недель, как было показано, чтобы обеспечить улучшенную функциональное восстановление ближе к аллотрансплантатов, текущего золотого стандарта для ремонта нерва 8,9.
Различные материалы и способы производства могут быть использованы для производства механической и Топографическаяаль киев 10-13. Механические сигналы присущи выбранного материала, что делает выбор соответствующей материала для применения критического 1,13. Методы производства контролировать топографические сигналы включают разделение фаз, самосборки и электропрядения 1,13. Для приложений, микромасштабных микрофлюидики, photopatterning, травление, соли выщелачивании или газа пены также можно использовать 14-17. Электропрядения стала самой популярной пути к инженеру волокнистые субстраты для тканевой культуры благодаря своей гибкости и простоте производства 13,18-23. Нановолокна изготавливают путем приложения высокого напряжения к полимерного раствора заставляя его отражению себя и протянуть короткого промежутка для выполнения 24. Выровнены каркас может быть создана путем сбора волокон на заземленной вращающейся оправке, и неприсоединившиеся каркасы собирают на неподвижной плите 25. Адгезия сигнализации может быть достигнуто путем нанесения покрытия на волокнистую базового интерфейса умч фибронектин или конъюгации адгезии пептид, например, РГД, к HA до электропрядения 26.
Химические сигналы, такие как факторы роста, наиболее трудно поддерживать в течение длительного периода, так как они нуждаются в источнике для контролируемого высвобождения. Многие системы были попытки добавить контролируемого высвобождения в electrospun волокнистых сетей с различной степенью успеха. Эти методы включают наложения электропрядения, эмульсии электропрядения, основной оболочки электропрядения и белка сопряжение 27. Кроме того, электропрядения традиционно делается в летучем растворителе, который может влиять на жизнеспособность белка 28, таким образом сохраняя биологическую активность белка должны быть рассмотрены.
Этот подход непосредственно касается объединения механические, топографические, химические и клейкие сигналы, чтобы создать настраиваемый каркас для роста периферических нервов. Механика Леса точно регулируется путем синтезаметакрилированные гиалуроновой кислоты (ГК). Сайты methacrylation применяются для крепления фото реактивные сшивателей. не сшитый материал уже не растворимы в воде и исключительно с разбивкой по ферментов 29. Степень сшивания изменяет скорость деградации, механики и другие физические свойства материала. Использование HA с 30% methacrylation, который имеет модуль упругости при растяжении ~ 500 Па, создает мягкий субстрат, который близок к родным механики нервной ткани и, как правило, предпочтительный для нейронов 26,29. Электропрядения на вращающейся оправке используется для создания выровненных волокон для топографической кия. Использование электропрядения наряду с микросфер обеспечивает химические сигналы в эшафот в течение длительного периода. Для поддержки нейрита микросферы роста содержащие NGF используются для создания химического сигнала. В отличие от большинства материалов electrospun ГА растворим в воде, так что NGF не сталкивается жесткие растворители в процессе производства. Чтобы добавить клейкую сигнал, СКСffold покрыта фибронектина. Заполненный система содержит все четыре типа сигналов, описанных выше: мягкие (механических) выровненных (топографических) волокон с NGF выпуская микросферы (химические), покрытую фибронектина (клея). Производство и тестирование этой системы описывается в данном протоколе.
Процесс начинается с производства микросфер с вода-в-масле-в-воде двойной эмульсии. Эмульсии стабилизируют, поверхностно-активного вещества, поливиниловый спирт (ПВС). Внутренняя водная фаза содержит белок. Как он будет добавлен к масляной фазе, содержащей материал оболочки PLGA растворяли в дихлорметане (ДХМ), поверхностно-активное вещество создает барьер между фазами, защищающих белка из DCM. Эта эмульсия является чем диспергируют в другой водной фазе, содержащей ПВС, чтобы создать внешнюю поверхность микросфер. Стабильная эмульсия перемешивают, чтобы позволить ДХМ испаряется. После промывки и лиофилизации вы остались с сухой микросфер продолжениеAining белок.
После того, как микросферы будут завершены, они будут готовы к electrospun в каркасах. Сначала вы подготовить электропрядения решение. Вязкость раствора имеет решающее значение для правильного формирования волокна. Решения чистого HA не отвечают этому требованию; ПЭО добавляется в качестве полимера-носителя, чтобы дать возможность электропрядения. Микросферы добавляют к раствору и electrospun в результате волокнистой строительные леса, с микросферами, распределенных по всему.
После того, как производство завершено, белок должен быть проверен, чтобы проверить свою жизнеспособность. Для этого, первичка, который реагирует на NGF может быть использован. Этот протокол использует ганглии задних корешков (DRG) с 8-10 дневных куриных эмбрионах. Клеточные пучки высевают на каркасах, содержащих микросферы, наполненные NGF или те, которые являются пустыми. Если NGF все еще жизнеспособна вы должны увидеть расширенную рост аксонов на NGF, содержащих лесов. Если NGF, больше не жизнеспособны он будетне способствует нейриты для расширения и должны выглядеть примерно контролем.
Точная процедура описано здесь сосредоточено на нервной поддержки, однако, с простых изменений в материале, методом электроформования и белков система может быть оптимизирована для различных типов клеток и тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Многие исследования показали, что нервные клетки могут быть направлены на топографических киев (выравнивания волокна) и химические сигналы (факторы роста) 1,2,10,11,35. Электропрядения является легким способом для создания выровненных волокон. Факторы роста стимулировать рост нервн?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially funded through the Richard Barber Foundation and a Thomas Rumble Fellowship (TJW).
Materials
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Irgacure 2959 | BASF | 24650-42-8 | Protect from light |
| PEO 900 kDa | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Syringe Pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Power Source | Gamma High Voltage | ES30P-5W | |
| Motor | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | EXFO | S1000 | |
| Needles | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Isoporopyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-500mL | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| BSA-FITC | Sigma-Aldrich | 080M7400 | |
| β-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 1156-NG | |
| 65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | 1001554270 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-2L | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Thermo Scientific | 1856209 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 1001558456 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| Glutamine | Fisher Scientific | G7513 | |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 |
Riferimenti
- Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. Directed migration in neural tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. , (2013).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Madduri, S., Gander, B. Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves. J Control Release. 161, 274-282 (2012).
- Madigan, N. N., McMahon, S., O’Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds. Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).
- Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. Engineering strategies for peripheral nerve repair. Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).
- Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair. Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).
- Bronzino, J. D., Peterson, D. R. . The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition – 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs. , (2006).
- Bell, J. H. A., Haycock, J. W. Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery. Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).
- Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. Designing ideal conduits for peripheral nerve repair. Neurosurgical focus. 26, (2009).
- Olakowska, E., Woszczycka-Korczyńska, I., Jędrzejowska-Szypułka, H., Lewin-Kowalik, J. Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review. Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).
- Gunn, J., Zhang, M. Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges. Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).
- Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth. Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).
- Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity. Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).
- Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Material strategies for creating artificial cell-instructive niches. Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).
- Annabi, N., et al. Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro. Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).
- Castaño, O., Eltohamy, M., Kim, H. -. W. Electrospinning technology in tissue regeneration. Methods Mol. Biol. 811, 127-140 (2012).
- Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers. Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).
- Han, D., Gouma, P. -. I. Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix. Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).
- Prabhakaran, M. P., et al. Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering. Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).
- Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. Electrospun nanofibers for neural tissue engineering. Nanoscale. 2, 35-44 (2010).
- Yao, L., O’Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
- Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior. Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).
- Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications. Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).
- Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
- Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
- Péan, J. M., et al. Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles. International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).
- Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells. Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).
- Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. . Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , (2003).
- Boer, R., et al. Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres. Microsurgery. 31, 293-302 (2011).
- Pujic, Z., Goodhill, G. J. A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen. Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloïzos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).
- Yan, Q., Yin, Y., Li, B. Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration. Biomed Eng Online. 11, (2012).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. , (2013).
- Li, X., et al. Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning. Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).
- Wang, C. -. Y., et al. The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration. J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).
- Liu, J. -. J., Wang, C. -. Y., Wang, J. -. G., Ruan, H. -. J., Fan, C. -. Y. Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning. J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).
