This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.
המחקר של התבגרות מערכת עצבים מרכזית (CNS) מסתמך על מיקוד גנטי של אוכלוסיות נוירונים. עם זאת, המשימה של הגבלת הביטוי של גנים המעניינים את תת עצביים ספציפיים הוכיחה להפליא מאתגרת בשל המחסור היחסי של אלמנטי אמרגן ספציפיים. interneurons GABAergic מהווה אוכלוסייה עצבית עם מגוון גנטי ומורפולוגיים נרחבים. ואכן, יותר מ -11 תת שונה של interneurons GABAergic מתאפיינים בקליפת העכבר 1. כאן אנו מציגים פרוטוקול מותאם למיקוד סלקטיבי של אוכלוסיות GABAergic. השגנו מיקוד סלקטיבי תת סוג של interneurons GABAergic על ידי שימוש באלמנט משפר של שעתוק homeobox גורמי Dlx5 וDlx6, homologues של גן דיסטלי פחות דרוזופילה (DLL) 2,3, לנהוג הביטוי של גנים ספציפיים באמצעות electroporation ברחם.
את חלק הארי של interneurons GABAergic קליפת המוח מקורן שני מבנים עובריים חולפים בשם הוד ganglionic המדיאלי וזנב (MGE וCGE בהתאמה) 4. Parvalbumin וinterneurons סומטוסטטין להביע מקורן בMGE ואילו Calretinin (Cr), Vasointestinal פפטיד (VIP) וReelin (Re) להביע interneurons מקורן CGE. ניתן להבחין תת interneuron אלה על ידי תאריכי הלידה שלהם. תת נגזר MGE נולדים בין יום העוברי 9.5 (E9.5) וE16.5 5,6. בניגוד לכך, interneurons CGE נגזר נולד מE12.5 דרך E18.5 עם הייצור שלהם הגיע לשיא של E15.5 6. המיקוד הגנטי של אוכלוסייה בסוף נולד זה, עם זאת, נותר חמקמק.
גנים העכבריים דיסטלי פחות (DLX) באים לידי ביטוי אך ורק במוח הקדמי הגחון פיתוח 3. interneurons GABAergic ונוירונים הקרנת striatal אבל תאים פירמידליים לא בקליפת המוח לבטא Dlx1, 2,5, ו -6 גנים בשלבי התפתחותיים מוקדמים 3. ואכן, גני DLX באים לידי ביטוי באזור subventricular MGE וCGE (SVZ) בכל אבות GABAergic. ביטוי של גנים אלה הופך מוגבל כדי לבחור תת בשלבי postmitotic 7-9. ראיות ניסיוניות קודמות הראו כי האלמנט משפר Dlx5 / 6 מאפשר למיקוד סלקטיבי של שושלות GABAergic במודלים של עכברים מהונדסים 2. אנחנו בדקנו את השימוש באחד מהאלמנטים משפר אלה בהקשר של ביטוי episomal במוח העכבר המתפתח. אנו תת משובטים האלמנט משפר Dlx5 / 6 יחד עם אמרגן מינימאלי והחלבון המשופר הירוק הניאון (eGFP) בפלסמיד עמוד השדרה bluescript (BS) (איור 1). אנחנו הצגנו את הפלסמיד באמצעות ברחם electroporation בE15.5 למקד Cr-, VIP באופן סלקטיבי והוא זכר תת 3,8,10. הטכניקה שלנו מאפשרת לelectroporation הדליל, המאפשרהבנייה מחדש של תכונות מורפולוגיות של תאים לחרוך. בנוסף, הרמות גבוהות במיוחד של ביטוי גנים בתאי עצב בקליפת המוח GABAergic מאפשרת ללימודים פונקציונליים. בצענו הפסד ורווח של מחקרים לתפקד באמצעות מספר סוג בר והגנים שליליים דומיננטיים 11.
מגבלות של הטכניקה
בעוד טכניקה זו מאפשרת ניתוח אוטונומי תא של תהליכים בתא, זה לא מתאים לניתוח אוכלוסייה. Electroporations מאוד דליל עם פחות מאלף תאים electroporated לכל מוח. כתוצאה מכך, הטכניקה לא ניתן להשתמש כדי להעריך את השלכות התנהגות הנובעות …
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לLihong יין לקבלת סיוע טכני. NVD הוא נמען פרס חוקר צעיר NARSAD של ונתמך גם על ידי מענקים מNIH (5 K99 MH095825-02). מחקר במעבדה Fishell נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות, המכון הלאומי לבריאות הנפש (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), מכון לאומי להפרעות ושבץ (5 R01 NS081297-02 נוירולוגיות, 1 P01 NS074972 -01A1) וסימונס הקרן.
Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
5mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0mm OD x 0.75mm ID |
Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |