This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.
Die Studie des Zentralnervensystems (ZNS) Reifung beruht auf genetischer Ausrichtung der neuronalen Populationen. Allerdings hat die Aufgabe, die Beschränkung der Expression von Genen von Interesse spezifischen neuronalen Subtypen bemerkensanspruchs aufgrund der relativen Knappheit von spezifischen Promotorelemente bewährt. GABAergen Interneuronen bilden einen neuronalen Population mit umfangreichen genetischen und morphologischen Vielfalt. Tatsächlich haben mehr als 11 verschiedene Subtypen von GABAergen Interneuronen in der Maus Kortex 1 gekennzeichnet. Hier präsentieren wir ein angepasstes Protokoll für selektive Ausrichtung der GABAergen Populationen. Wir erreicht Subtyp selektive Ausrichtung von GABAergen Interneuronen mit Hilfe der Enhancer-Element des Homeobox Transkriptionsfaktoren Dlx5 und Dlx6, Homologen des Drosophila-Distal-less (DLL)-Gen 2,3, um die Expression spezifischer Gene durch in utero Elektroporation zu fahren.
Der Großteil der kortikalen GABAergen Interneuronen stammen aus zwei transiente embryonale Strukturen nannte die medialen und Schwanzganglien Eminenzen (MGE und CGE jeweils) 4. Parvalbumin und Somatostatin exprimierenden Inter entstehen in der Erwägung, dass MGE Calretinin (Cr), Vasointestinal Peptid (VIP) und Reelin (Re) ausdrückt Inter stammen aus der CGE. Diese Intern Subtypen können durch ihre Geburtsdaten unterschieden werden. MGE abgeleitet Subtypen zwischen embryonalen Tag 9.5 (E9.5) und E16.5 5,6 geboren. Im Gegensatz dazu CGE abgeleitet Inter aus E12.5 E18.5 durch ihre Produktionshöchststand von 6 E15.5 geboren. Die genetische Targeting dieser spät geboren Bevölkerung bleibt jedoch unklar.
Die murinen Distal-less (Dlx) Gene werden ausschließlich in den Entwicklungs ventralen Vorderhirn 3 ausgedrückt. GABAergen Interneuronen und Projektionsneuronen des Striatums, aber nicht Pyramidenzellen der Hirnrinde auszudrücken DLX1, 2,5, und 6 Gene in frühen Entwicklungsstadien 3. Tatsächlich sind die Deluxe, Gene in der MGE und CGE Subventrikularzone (SVZ) in allen GABAergen Vorläuferzellen exprimiert wird. Expression dieser Gene wird eingeschränkt, um Subtypen bei postmitotische Stufen 7-9 wählen. Vorherige experimentelle Beweismaterial zeigte, daß das Dlx5 / 6 Enhancer-Element ermöglicht die selektive Ausrichtung der GABAergen Linien in transgenen Mausmodellen 2. Wir haben die Verwendung von einer dieser Enhancer-Elementen im Rahmen der episomalen Expression in sich entwickelnden Maus-Gehirn. Wir Teil zusammen mit einem Minimalpromotor und dem enhanced green fluorescent protein (eGFP) in einen Bluescript (BS) Backbone-Plasmid (Figur 1) kloniert den Dlx5 / 6-Enhancer-Element. Wir haben das Plasmid durch Elektroporation in utero bei E15.5 selektiv auf Cr-, VIP-und Research-Subtypen 3,8,10. Unsere Technik ermöglicht spärlich Elektroporation, die erleichtertdie Rekonstruktion der morphologischen Merkmale singe Zellen. Darüber hinaus ist die außerordentlich hohe Genexpression in kortikalen GABAergen Neuronen ermöglicht funktionelle Studien. Wir führten Verlust und Gewinn von Funktionsprüfungen mit mehreren Wildtyp und dominant negative Gene 11.
Grenzen der Technik
Während diese Technik ermöglicht Zelle autonom Analyse von Zellprozessen, ist es nicht geeignet für die Populationsanalyse. Die Elektroporationen sind sehr spärlich mit weniger als tausend Zellen elektroporiert pro Gehirn. Als Folge kann die Technik nicht verwendet werden, um Verhaltenskonsequenzen durch die genetische Manipulation von CGE abgeleiteten Inter bewerten.
Während Elektroporationen durchgeführt bei E13.5 E14.5-Ziel MGE-Subtyp…
The authors have nothing to disclose.
Wir sind dankbar, dass Lihong Yin für technische Unterstützung. NVD ist ein Empfänger einer NARSAD Young Investigator Award und wird auch durch Zuschüsse aus NIH (5 K99 MH095825-02) unterstützt. Forschung im Labor Fishell wird durch das National Institute of Health, National Institute of Mental Health (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (5 R01 NS081297-02 unterstützt, 1 P01 NS074972 -01A1) und der Simons Foundation.
Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
5mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0mm OD x 0.75mm ID |
Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |