Cortical interneurons के उपप्रकार चयनात्मक Electroporation
Summary
This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.
Abstract
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) परिपक्वता का अध्ययन neuronal आबादी की आनुवंशिक लक्ष्यीकरण पर निर्भर करता है. हालांकि, विशिष्ट neuronal उपप्रकारों के लिए ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति को सीमित करने के कार्य की वजह से विशिष्ट प्रमोटर तत्वों के सापेक्ष कमी उल्लेखनीय चुनौतीपूर्ण साबित हो गया है. GABAergic interneurons व्यापक आनुवंशिक और रूपात्मक विविधता के साथ एक neuronal जनसंख्या का गठन. दरअसल, GABAergic interneurons के 11 से अधिक विभिन्न उपप्रकारों माउस प्रांतस्था 1 में लक्षण वर्णन किया गया है. यहाँ हम GABAergic आबादी के चुनिंदा लक्ष्यीकरण के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. हम homeobox प्रतिलेखन के बढ़ाने तत्व का उपयोग करके GABAergic interneurons के उप चयनात्मक लक्ष्यीकरण हासिल utero electroporation में विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति के माध्यम से ड्राइव करने के लिए Dlx5 और Dlx6, ड्रोसोफिला बाहर का कम (DLL) जीन 2,3 की homologues, कारकों.
Introduction
कॉर्टिकल GABAergic interneurons की थोक औसत दर्जे का है और दुम ganglionic eminences (क्रमशः MGE और CGE) नामक दो क्षणिक भ्रूण संरचनाओं से उत्पन्न 4. Parvalbumin और सोमेटोस्टैटिन व्यक्त interneurons interneurons CGE से उत्पन्न व्यक्त Calretinin जबकि MGE (सीआर), Vasointestinal पेप्टाइड (वीआईपी) और Reelin (आरई) में आरंभ. ये interneuron उपप्रकार उनके birthdates से प्रतिष्ठित किया जा सकता. MGE व्युत्पन्न उपप्रकार भ्रूण दिन 9.5 (E9.5) और e16.5 5,6 के बीच पैदा होते हैं. इसके विपरीत, CGE व्युत्पन्न interneurons उनके उत्पादन E15.5 6 पर बढ़ता जा साथ E18.5 से E12.5 से पैदा होते हैं. यह देर से पैदा हुए आबादी की आनुवंशिक लक्ष्यीकरण, तथापि, मायावी बनी हुई है.
murine बाहर का कम (DLX) जीन विशेष रूप से विकासशील उदर अग्रमस्तिष्क 3 में व्यक्त कर रहे हैं. GABAergic interneurons और striatal प्रक्षेपण न्यूरॉन्स लेकिन नहीं कॉर्टिकल पिरामिड कोशिकाओं Dlx1 व्यक्त, जल्दी विकास के चरणों 3 में 2,5, और 6 जीन. दरअसल, DLX जीन सभी GABAergic progenitors में MGE और CGE subventricular क्षेत्र (SVZ) में व्यक्त कर रहे हैं. इन जीनों की अभिव्यक्ति postmitotic चरणों 7-9 पर उपप्रकार को चुनने के लिए सीमित हो जाता है. पिछले प्रयोगात्मक सबूत Dlx5 / 6 बढ़ाने तत्व ट्रांसजेनिक माउस मॉडल 2 में GABAergic प्रजातियों के चुनिंदा लक्ष्यीकरण के लिए अनुमति देता है कि पता चला है. हम विकासशील माउस मस्तिष्क में episomal अभिव्यक्ति के संदर्भ में इन बढ़ाने तत्वों में से एक का उपयोग परीक्षण किया. हम एक न्यूनतम प्रमोटर और एक bluescript (बी एस) रीढ़ प्लाज्मिड में बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) (चित्रा 1) के साथ मिलकर Dlx5 / 6 बढ़ाने तत्व क्लोन उप. हम चुनिंदा Cr-, वीआईपी लक्षित करने के लिए E15.5 पर utero में electroporation के माध्यम से प्लाज्मिड शुरू की है और पुनः 3,8,10 उपप्रकार. हमारी तकनीक की सुविधा जो विरल electroporation, के लिए अनुमति देता हैझुलसाना कोशिकाओं की रूपात्मक सुविधाओं के पुनर्निर्माण. इसके अलावा, कॉर्टिकल GABAergic न्यूरॉन्स में जीन अभिव्यक्ति की असाधारण उच्च स्तर कार्यात्मक अध्ययन के लिए अनुमति देता है. हम नुकसान और कई जंगली प्रकार और प्रमुख नकारात्मक जीन 11 का उपयोग करते हुए समारोह के अध्ययन के लाभ से बाहर किया.
Protocol
Representative Results
Discussion
तकनीक की सीमाएं
इस तकनीक को सेल प्रक्रियाओं की सेल स्वायत्त विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, यह जनसंख्या के विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है. electroporations मस्तिष्क प्रति electroporated कम से कम एक हजार कोशिका…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम तकनीकी सहायता के लिए Lihong यिन के लिए आभारी हैं. NVD एक NARSAD युवा अन्वेषक पुरस्कार के एक प्राप्तकर्ता है और भी एनआईएच (5 K99 MH095825-02) से अनुदान द्वारा समर्थित है. Fishell प्रयोगशाला में अनुसंधान, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, मानसिक स्वास्थ्य (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09) के राष्ट्रीय संस्थान, मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक (5 R01 NS081297-02 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित है 1 P01 NS074972 -01A1) और सिमंस फाउंडेशन.
Materials
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0mm OD x 0.75mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
Riferimenti
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