This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.
Merkezi sinir sistemi (CNS) olgunlaşma çalışma sinirsel genetik hedefleme dayanır. Bununla birlikte, özel nöron alt tiplerine ilgi genlerinin ekspresyonunu kısıtlama görev nedeniyle spesifik promoter elementlerinin nispeten kıt olması oldukça zor olduğu kanıtlanmıştır. GABA'erjik internöron geniş genetik ve morfolojik çeşitliliği olan bir nöronal nüfus oluşturmaktadır. Gerçekten de, GABAerjik internöron fazla 11 farklı alt tipi fare korteksi 1 ile karakterize edilmiştir. Burada GABAerjik nüfus seçici hedefleme için uyarlanmış bir protokol mevcut. Bu homeobox transkripsiyon enhanser elemanını kullanarak, GABAerjik internöron alt tip seçici olarak hedeflenmesini elde utero elektroporasyon spesifik genlerin ekspresyonunu ile sürücü ve Dlx5 Dlx6, Drosophila uzak-az (DLL) geni 2,3 homologlarını, faktörüdür.
Kortikal GABAerjik internöronlar toplu medial ve kaudal ganglion eminences (sırasıyla MGE ve JMO) adında iki geçici embriyonik yapılarından kaynaklanan 4. Parvalbumin ve somatostatin ifade internöron internöron JMO'ya kaynaklanan ifade Kalretinin ise MGE (Cr), Vasointestinal peptid (VIP) ve Reelin (Re) köken. Bu interneuron alt tipler kendi doğum günlerinin ile ayırt edilebilir. MGE türetilmiş alt tipler embriyonik gün 9.5 (E9.5) ve e16.5 5,6 arasında doğarlar. Buna karşılık, JMO türetilmiş internöron üretim E15.5 6 seviyesinde zirve ile E18.5 yoluyla E12.5 doğar. Bu geç doğdu nüfusun genetik hedefleme, ancak, zor kalır.
Kemirgen distal-az (Dlx) genler sadece gelişmekte olan ventral önbeyin 3 olarak ifade edilmiştir. GABAerjik internöron ve striatum projeksiyon nöronları değil, kortikal piramidal hücreleri Dlx1 ifade, Erken gelişim evrelerinde 3 de 2,5, ve 6 genler. Gerçekten de, dlx genlerinin hepsi GABA'erjik atalarda MGE ve CGE subventricular (SVZ'una) olarak ifade edilmiştir. Bu genlerin sentezlenmesi postmitotik aşamalarında 7-9 de alt tiplerini belirlemek için kısıtlanır. Önceki deneysel kanıtlar Dlx5 / 6 arttırıcı bir eleman transgenik fare modellerinde 2 GABAerjik soy seçici hedefleme için izin verdiğini gösterdi. Bu, gelişmekte olan fare beyin epizomal ifade bağlamında bu zenginleştirici elemanların birinin kullanılmasını test edilmiştir. Bir minimal promotör ve Bluescript (BS) omurga plasmid olarak gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) (Şekil 1) ile birlikte Dlx5 / 6 güçlendirici elemanın alt klonlandı. Burada özellikle Cr, VIP hedef E15.5 rahimde elektroporasyon suretiyle plazmid tanıtıldı ve Yeniden 3,8,10 alt tip. Bizim teknik kolaylaştırır seyrek elektroporasyon, sağlarateşten hücrelerin morfolojik özellikleri yeniden. Buna ek olarak, kortikal nöronlarda GABAerjik gen ekspresyonu son derece yüksek seviyelerde fonksiyonel çalışmalarda da sağlar. Biz kaybı ve çeşitli yabani tip ve dominant negatif genler 11 ile fonksiyon testleri kazancını gerçekleştirilir.
Tekniğin Sınırlamalar
Bu teknik, hücre süreçlerinin hücre özerk analizi için sağlar, bu popülasyon analizi için uygun değildir. Electroporations beyin başına elektropore az bin hücreleri ile çok seyrek. Bunun bir sonucu olarak, bu teknik CGE türetilmiş internöron genetik manipülasyon kaynaklanan davranış sonuçlarını değerlendirmek için kullanılamaz.
Elektroporasyon E13.5-E14.5 hedef MGE türetilmiş alt tiplerinde üzerinden taşınan…
The authors have nothing to disclose.
Biz teknik yardım için Lihong Yin minnettarız. NVD bir NARSAD Genç Araştırmacı Ödülü bir alıcı ve aynı zamanda NIH (5 K99 MH095825-02) hibe tarafından desteklenmektedir. Fishell laboratuarında Araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, Ruh Sağlığı (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09) Ulusal Enstitüsü, Nörolojik Bozukluklar ve İnme (5 R01 NS081297-02 Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen 1 P01 NS074972 -01A1) ve Simons Vakfı.
Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
5mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0mm OD x 0.75mm ID |
Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |