Capire in anticipo Organogenesis Utilizzando una semplificata<em&gt; In Situ</em&gt; Protocollo di ibridazione in<em&gt; Xenopus</em

Steven J. Deimling; Rami R. Halabi; Stephanie A. Grover; Jean H. Wang; Thomas A. Drysdale

doi:10.3791/51526

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Articolo metodologico

Capire in anticipo Organogenesis Utilizzando una semplificata

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DOI:

10.3791/51526

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12 gennaio 2015

Steven J. Deimling¹ , Rami R. Halabi²^,³ , Stephanie A. Grover⁴ , Jean H. Wang²^,⁵ , Thomas A. Drysdale²^,⁴^,⁵

¹Developmental and Stem Cell Biology, Hospital for Sick Children, ²Children's Health Research Institute, University of Western Ontario, ³Department of Physiology and Pharmacology, University of Western Ontario, ⁴Neurosciences and Mental Health, Hospital for Sick Children, ⁵Department of Paediatrics, University of Western Ontario

In questo articolo

Sommario

L'embrione di Xenopus laevis continua ad essere eccezionalmente utile nello studio dello sviluppo precoce grazie alle sue grandi dimensioni e alla facilità di manipolazione. Viene fornito un protocollo semplificato per l'ibridazione in situ dell'intera montatura che può essere utilizzato nell'identificazione di organi specifici in questo sistema modello.

Abstract

L'organogenesi è lo studio di come gli organi vengono specificati e quindi acquisiscono la loro forma e funzioni specifiche durante lo sviluppo. L'embrione di Xenopuslaevis è molto utile per lo studio dell'organogenesi perché le sue grandi dimensioni lo rendono molto adatto per identificare gli organi nelle prime fasi dell'organogenesi. Al momento, il metodo principale utilizzato per identificare un organo specifico o primordio è l'ibridazione in situ a montatura intera con sonde di RNA antisenso marcate specifiche per un gene che è espresso nell'organo di interesse. Inoltre, è relativamente facile manipolare i geni o le vie di segnalazione in Xenopus e l'ibridazione in situ consente di analizzare i cambiamenti nella presenza o nella morfologia di un organo bersaglio. L'ibridazione in situ dell'intera montatura è un protocollo di più giorni con molti passaggi coinvolti. Qui forniamo un protocollo semplificato con un numero ridotto di passaggi e reagenti utilizzati che funziona bene per i test di routine. I robot di ibridazione in situ hanno notevolmente facilitato il processo e descriviamo in dettaglio come e quando utilizziamo tale tecnologia nel processo. Una volta completata l'ibridazione in situ, catturare l'immagine migliore del risultato può essere frustrante. Forniamo consulenza su come ottimizzare l'imaging dei risultati dell'ibridazione in situ. Sebbene il protocollo descriva la valutazione dell'organogenesi in Xenopus laevis, lo stesso protocollo di base può quasi certamente essere adattato a Xenopus tropicalis e ad altri sistemi modello.

Introduzione

Il modello di espressione di un gene specifico è un'informazione importante nel determinare il ruolo potenziale di quel gene nello sviluppo di un organo o di un tipo di cellula specifico. In poche parole, se non viene espresso al momento e nel luogo giusto, è improbabile che svolga un ruolo chiave. In Xenopus, come nella maggior parte degli embrioni precoci, il test più comunemente usato per rilevare l'espressione di un gene è l'ibridazione in situ a montaggio intero utilizzando sonde di RNA antisenso marcate. L'uso della colorazione degli anticorpi per valutare l'espressione di un gene in Xenopus sta diventando sempre più comune man man....