Sonikering-tilrettelagt Immunfluorescens Farging av sent stadium Embryonic og larve<em> Drosophila</em> Vev<em> In Situ</em

Summary

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Abstract

Studier utført i Drosophila melanogaster embryo og larver gi avgjørende innsikt i utviklingsprosesser som celle skjebne spesifikasjon og organogenesis. Immunostaining tillater visualisering av utvikling av vev og organer. Imidlertid er en beskyttende hårstråene som dannes ved enden av embryogenesen hindrer gjennomtrengning av antistoffer i sene stadier av befruktede egg og larver. Mens disseksjon før farging blir jevnlig brukt til å analysere Drosophila larver vev, beviser det ineffektivt for noen analyser fordi små vev kan være vanskelig å lokalisere og isolere. Sonikering gir et alternativ til disseksjon i larve Drosophila farging protokoller. Det gir mulighet for rask, samtidig behandling av et stort antall sene stadier av befruktede egg og larver og vedlikeholder in situ morfologi. Etter fiksering i formaldehyd, er et eksempel sonikert. Prøven blir deretter utsatt for farging med antigen-spesifikke primære mauribodies og fluorescensmerkede sekundære antistoff for å visualisere target celletyper og spesifikke proteiner via fluorescens mikroskopi. Under prosessen med sonikering, er passende plassering av en sonisk sonde over prøven, så vel som varigheten og intensiteten av sonikering, kritisk. Kan være nødvendig Ytterligere mindre modifikasjoner til standard farging protokoller for høy kvalitet flekker. For antistoffer med lav signal til støyforhold, lengre inkubasjonstid er vanligvis nødvendig. Som et bevis på konseptet for denne sonication-tilrettelagt protokollen, viser vi immunostains av tre vevstyper (testikler, eggstokker, og nervevev) på en rekke utviklingsstadier.

Introduction

Drosophila embryo og larver gir en utmerket modell for å studere utviklingsprosesser i mange organer og vev. Avbildning av individuelle celler er ofte nødvendig i disse studiene for å fastslå de komplekse miljøer der cellene utvikler. Visualisering av celler i vev kan oppnås ved farging. Godt beskrevet farging protokoller finnes for embryonale Drosophila vev <17 timer etter egglegging (AEL) ^1-3. Imidlertid en beskyttende cuticle former mot slutten av embryogenesen, hindrer effektivt antistoff gjennomtrengning. Dermed disse Immunostaining protokollene er ineffektive i analysen av vev i sene stadier av embryoer og i senere stadier av larveutvikling (1 ^st instar (L1), ^2. instar (L2), og ^3. instar (L3)). Dette ineffektivitet pålegger en barriere til vår forståelse av dynamiske prosesser som oppstår under denne utvidede utviklingsperioden ^fire. Tissue disseksjon er en mye brukt teknikk for å omgå denne barrieren ^5-7. Kan imidlertid vise seg å være ineffektiv disseksjon. Utvinning kan være beheftet med problemer med å finne eller isolere embryonale og larve vev. Videre kan den fysiske fjerning av målvev forårsake skade ved å sprekker dem eller ved å unnlate å pakke dem i sin helhet.

Sonikering er en metode som benytter lydbølger å forstyrre intermolekylære interaksjoner. Det har blitt benyttet for å forstyrre integriteten til Drosophila larve hårstråene for å utvikle immunostain nevrale celletyper ^6. Denne protokollen er tilpasset immunostain sent stadium embryonale og larve gonader, som kan være så liten som 50 ym i diameter ^8-10. Gjennom slike studier, har prosessen med mannlige germline stamcelle (GSC) nisje dannelse vært preget i sent stadium Drosophila embryoer ^8-10 og mekanismer som regulerer stamcelle utvikling og differentiation i sent stadium embryonale gonader og larver har blitt belyst ^9-12. Således gir sonikering et effektivt alternativ til vev disseksjon som kan være vanskelig på grunn av vev størrelse. Videre muliggjør den farging av Drosophila vev in situ, slik at cellene innenfor rammen av hele organismen og opprettholde in situ morfologi. Her beskriver vi en steg-for-steg-protokollen for fluorescens farging av sent stadium embryonale gjennom tidlig / midten av L3 vev i situ. Analyse av Drosophila gonadal og nervevev er vist i de representative resultater for å demonstrere effekten av denne protokollen. Videre kan denne farging protokollen kan tilpasses for å analysere andre Drosophila vev, så vel som vev i andre organismer med en ytre hårstråene.

Protocol

1. Utarbeidelse av en opphenting Cage Anesthetize unge, fruktfluer med CO 2. Overfør bedøvede fluer til et bur. For å oppnå optimal avkastning, bruker 100-120 voksne fluer som strekker seg fra 2-7 dager gammel på et 4: 1-forhold av kvinner til menn. Tillat fluer en passende akklimatiseringsperiode, ~ 24 timer før prøven for å oppnå fiksering. Hvis buret ble satt opp med jomfruelige kvinner parret til menn, en bruk en 36 – 48 timers akklimatiseringsperiode. På den åpne enden av …

Representative Results

For å demonstrere effekten av sonikering basert farging i analyse av sent stadium av embryo og larve vev in situ, ble villtype-embryoer og larver behandlet for farging av testiklene, eggstokkene, og nervevev. Prøver ble fotografert via konfokal mikroskopi og representative resultatene er vist (figur 1 og figur 2). Resultatene viser at den beskrevne protokollen er effektivt for å visualisere morfologiske funksjoner samt individuelle celler i situ under sene-embryonal…

Discussion

Denne protokollen gir en metode for å lykkes immunostain målrette Drosophila embryonale og larve vev in situ, og dermed eliminere behovet for disseksjon. Som per tidligere protokoller for farging tidlige embryoer ^1,2,3, er chorionic membranen fjernes med 50% blekemiddel (NaOCl). Prøver er løst i formaldehyd og metanol. Fordi larve hårstråene forårsaker eldre prøve til å flyte, er hele prøven deretter ført gjennom en celle-sil for å sikre larve retensjon. Prøve er lagret, hvis ø…

Materials

			Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate Buffer Triton X-100 (PBTx)	For 5 L: 500 mL PBS 10X 4.45 L ddH2O 50 mL Triton 10%	Store at room temperature.
Phosphate Buffer Saline 10x (PBS 10X)	For 1 L in dH2O: 80 g NaCl 2 g KCl 14.4g Na2HPO4 2.4 g KH2PO4	Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 degrees C.
Triton 10%	For 50 mL: 5 mL of Triton 5 mL of PBS 10X 45 mL of ddH2O	Rock to mix. Store at room temperature.
PEMS	0.1 M Pipes (pH 6.9) 2.0 mM MgSO4 1.0 mM EGTA	Store at room temperature.
Pipes	For a 400ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH	Dissolve Pipes in 300 mL dH2Oand then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 mL with dH2O and autoclave. Store at room temperature.
Formaldehyde	37% formaldehyde by weight in methanol	Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane	n-Heptane	CAS 142-82-5. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol	Methanol	CAS 67-56-1. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate Buffer Tween (PBTw)	To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10%	Filter sterilize after adding all components. Store at 4 degrees C.
Tween 10%	For 50 mL: 5 mL Tween 5 mL of PBS 10X 40 mL of ddH2O	Rock to mix. Store at room temperature.
Bovine Serum Albumin/Phosphate Buffer Tween (BBTw)	To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10% 1 g Bovine Serum Albumin (BSA)	Add BSA then sterilize using a 0.2 micrometer vacuum filter unit. Store at 4 degrees C.
Normal Goat Serum (NGS)	To make 10 mL: Normal Goat Serum (Jackson ImmunoResearch Laboratories Code: 005-000-121) 10 mL ddH2O	Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 micrometer syrninge filter. Store aliquots at -20 degrees C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)	To make 100 mL: 25 mL ddH2O 1 mL Tris HCl (1M, pH 7.5) 2.5 g of DABCO solid (CAS: 281-57-9) 3.5 mL 6N HCl 250 uL 10N NaOH 70 mL glycerol	In 250 mL beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 degrees C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) Solution	1.765 mL NaHCO3 0.353 Na2CO3 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3)	Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 uL of PPD solution to 500 uL of DABCO. Store aliquots at -20 degrees C.
Apple juice plates	To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0) 45 g granulated sugar (store bought) 500 mL Apple juice (store bought) 15 mL Tegosept 10% 1.5 mL ddH2O	Add agar to ddH2O in 4L flask then autoclave for 30 minuntes. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10mL volumes into 35 mm petri dishes and let stand at room temperature to solidfy. Store at 4 degrees C.
Tegosept 10%	To make 100mL: 10g Tegosept 100 mL Ethanol	Store aliquots at -20 degrees C
Yeast paste	~50 g Dry Active Yeast	Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 degrees C.
			Table 2: Staining Materials
DAPI	1:1000	Invitrogen	D3571 //// Stock at 5mg/mL
rabbit anti-Vasa	1:250		A gift from Ruth Lehmann
mouse anti-Fasciclin III	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10
mouse anti-1B1	1:4	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
guniea pig anti-Traffic Jam	1:2500		A gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003)
mouse anti-Prospero	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A
rat anti-Elav	1:30	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Rat-elav 7EBA10 anti-elav
mouse anti-Repo	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	8D12 anti-Repo
goat anti-rabbit Alexa546	1:500	Invitrogen	A11010
goat anti-mouse Alexa488	1:500	Invitrogen	A11029
goat anti-guniea pig Alexa633	1:500	Invitrogen	A21105
goat anti-rat Alexa488	1:500	Invitrogen	A11006
			Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages	Hand-made; Genesee Scientific Corporation	Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101	Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier	Branson	Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator Probe	Branson	Model #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter	Nalgene	190-25-20	0.2 micrometer cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software	Microscope: Olympus Light source: Lumen Dynamics Camera: Q-Imaging Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.	Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc Light source: X-Cite 120Q Camera: RETIGA-SRV Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit	Nalgene	450-0020	0.2 micrometer cellulose nitrate membrane filter