एक कदम Strep-Tactin राल बीआईएस (sulfosuccinimidyl) के साथ पार से जुड़े Suberate (BS3) पर ट्विन Strep टैग प्रोटीन और उनके परिसरों का शोधन
Summary
एक विधि (Strep-Tactin) राल covalently बीआईएस (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) के साथ पार से जुड़े संशोधित streptavidin पर जुड़वां Strep टैग फ्यूजन प्रोटीन और उनके विशिष्ट परिसरों के कुशल शुद्धि के लिए वर्णित है. विधि तेज गति, अच्छा लक्ष्य प्रोटीन वसूली और उच्च शुद्धता के फायदे हैं, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा बाद के विश्लेषण के साथ संगत है.
Abstract
एक इंजीनियर streptavidin (Strep-Tactin) ले जाने रेजिन पर Strep टैग फ्यूजन प्रोटीन के संबंध शुद्धीकरण शारीरिक शर्तों के तहत प्रोटीन परिसरों के अलगाव के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल तरीका बन गया है. जुड़वां Strep टैग या SIII टैग नामित Strep टैग द्वितीय की दो प्रतियां, जिसमें फ्यूजन प्रोटीन इस प्रकार अधिक कुशल प्रोटीन शुद्धि की अनुमति, केवल एक ही Strep टैग युक्त उन लोगों की तुलना Strep-Tactin के लिए उच्च संबंध का लाभ दिया है. हालांकि, यह लाभ बायोटिन साथ जुड़वां Strep टैग प्रोटीन की क्षालन कम प्रोटीन वसूली के लिए अग्रणी, अपूर्ण हो सकती है कि इस तथ्य के द्वारा ऑफसेट है. वसूली में नाटकीय रूप से सोडियम सल्फेट dodecyl (एसडीएस) के साथ denaturing क्षालन का उपयोग करके सुधार किया जा सकता है, लेकिन यह नीचे की ओर प्रोटिओमिक विश्लेषण के साथ परख असंगत बनाने, राल से जारी Strep-Tactin साथ संदूषण नमूना की ओर जाता है. इस सीमा को पार करने के लिए, हम एक विधि Strep-Tactin की जिससे राल मिलकर टेट्रामर विकसित किया हैपहले सहसंयोजक बीआईएस (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) के साथ पार से जोड़ने और जिसके परिणामस्वरूप पार से जुड़े राल तो एक ही बैच शोधन चरण में लक्ष्य प्रोटीन परिसरों को शुद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है द्वारा स्थिर है. Strep-Tactin contaminating के अभाव मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा डाउनस्ट्रीम प्रोटीन विश्लेषण की अनुमति देता है, जबकि एसडीएस के साथ कुशल क्षालन, अच्छा प्रोटीन वसूली सुनिश्चित करता है. अवधारणा के एक सबूत के रूप में, हम वायरस से संक्रमित एन के नाभिक से VPG समर्थक SIII टैग वायरल प्रोटीन की शुद्धि के लिए यहाँ एक प्रोटोकॉल का वर्णन BS3 साथ पार से जुड़े Strep-Tactin polymethacrylate राल का उपयोग benthamiana पौधों. एक ही प्रोटोकॉल ब्याज की किसी भी जुड़वां Strep टैग प्रोटीन को शुद्ध और अपनी शारीरिक बंधन भागीदारों को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
हाल के वर्षों में, Strep टैग प्रौद्योगिकी प्रोटिओमिक्स और संरचनात्मक जीव विज्ञान सहित जैव चिकित्सा अनुसंधान के कई क्षेत्रों में व्यापक रूप से इस्तेमाल हो गया है. एक छोटी Strep टैग पेप्टाइड को पुनः संयोजक प्रोटीन के विलय पर निर्भर करता है जो इस प्रोटीन शुद्धीकरण प्रौद्योगिकी, Strep-Tactin, बेहतर पेप्टाइड बंधन क्षमता के साथ streptavidin की एक अनुवांशिक इंजीनियर संस्करण ले जाने आत्मीयता matrices के आगमन के साथ परिपक्व हो गया है. 1, 2 जुड़वां Strep टैग या SIII टैग, प्रदर्शन पुनः संयोजक प्रोटीन की अधिक कुशल शुद्धि सुनिश्चित करने, केवल एक ही Strep टैग युक्त उन से Strep-Tactin matrices के लिए एक उच्च आत्मीयता और नामित Strep टैग द्वितीय की दो प्रतियां, जिसमें फ्यूजन प्रोटीन उनके संबद्ध बंधन भागीदारों. हालांकि, Strep-Tactin को जुड़वां Strep टैग प्रोटीन का उच्च आत्मीयता भी इसके नकारात्मक पहलू है. अतिरिक्त बायोटिन के साथ प्रोटीन की प्रतियोगी क्षालन लक्ष्य प्रोटीन उपज में कमी आई करने के लिए अग्रणी, अपूर्ण हो सकती है. एक मीटरअयस्क कुशल वैकल्पिक एसडीएस के साथ क्षालन है, लेकिन यह प्रोटिओमिक विश्लेषण के साथ परख असंगत बनाने, राल से जारी Strep-Tactin साथ अवांछित नमूना संदूषण की ओर जाता है. इस पत्र में पहले रासायनिक पार से जोड़ने से Strep-Tactin की राल मिलकर टेट्रामर स्थिर और फिर जिसके परिणामस्वरूप पार से जुड़े राल से दो Strep टैग प्रोटीन और उनके संबद्ध परिसरों elute को एसडीएस का उपयोग करके इस सीमा को पार करने के लिए एक तकनीक प्रस्तुत करता है. इस प्रकार, पर्याप्त प्रोटीन उपज है, जिससे जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा आगे विश्लेषण की अनुमति, Strep-Tactin साथ नमूना संदूषण के बिना हासिल किया जा सकता है.
विधि एक सतह उजागर SIII टैग 3 या जुड़वां Strep टैग (अमीनो एसिड अनुक्रम WSHPQFEK (GGGS) क्रमश: 3 WSHPQFEK और SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK,) के साथ किसी भी पुनः संयोजक संलयन प्रोटीन की शुद्धि के लिए उपयुक्त है. प्रोटीन पशु, पौधे या बैक्टीरियल मूल का हो सकता है और कुल सेल या तो से अलग किया जा सकता हैlysate या समृद्ध organelle अंश. एक उदाहरण के रूप में, हम यहाँ PVA संक्रमित निकोटियाना benthamiana पौधों की परमाणु अंश से आलू वायरस ए (PVA) 4 के एक SIII टैग प्रोटीन VPG समर्थक की शुद्धि का वर्णन. पहले से निम्नलिखित संशोधनों के साथ, 5 में वर्णित के रूप में परमाणु अंश पृथक किया गया: कोशिकाओं formaldehyde के साथ इलाज नहीं किया गया, सोडियम butyrate 5 मिमी सोडियम फ्लोराइड के साथ सभी बफ़र्स में प्रतिस्थापित किया गया था, पूरा protease अवरोध PMSF साथ प्रतिस्थापित किया गया था, निकासी में ट्राइटन X-100 एकाग्रता बफर # 2 0.3% करने के लिए उतारा गया (वी / वी) और (निष्कर्षण बफर # 3) सुक्रोज तकिया के माध्यम से centrifugation द्वारा प्राप्त परमाणु गोली पूर्व ठंडा बाध्यकारी बफर के 1.45 मिलीलीटर में resuspended किया गया था और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के लिए घुमाया SIII टैग चारा प्रोटीन और जुड़े परिसरों (चारा प्रोटीन नमूना) युक्त जिसके परिणामस्वरूप परमाणु निकालने (खंड 2 देखें) नीचे वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार संसाधित किया गया था.
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊपर प्रोटोकॉल बायोटिन या मजबूत denaturants शामिल नहीं करता है कि किसी भी उपयुक्त बफर में ब्याज और उसके संबंधित परिसरों से किसी जुड़वां Strep टैग चारा प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रोटो?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कृतज्ञता सिनी Miettinen, मिन्ना Pöllänen और Taru Rautavesi की तकनीकी सहायता को स्वीकार करते हैं. हम HEK ध्वनि रिकॉर्डिंग उपकरण उपलब्ध कराने के लिए दो Strep टैग GFP और Pekka Evijärvi व्यक्त 293 कोशिकाओं को प्रदान करने के लिए Helka Nurkkala धन्यवाद. इस काम फिनलैंड के अकादमी द्वारा वित्त पोषित किया गया, संख्या 138329, 134684 और 258978 अनुदान.
Materials
| Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2mg | Pierce/Thermo Scientific | 21585 | www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection. |
| Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) | IBA | 2-1505 | www.iba-lifesciences.com |
| Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile | Costar (Corning) | 8163 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Dolphin-nose tubes | Costar (Corning) | 3213 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Avidin | IBA | 2-0204 | www.iba-lifesciences.com |
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