In vitro-cellekultur Model for Toxic Inhaleret Chemical Testing
Summary
Denne protokol er udviklet til at påvise eksponering metode cellekulturer til inhaleret giftige kemikalier. Eksponering af differentieret luft-væske grænsefladen (ALI) kulturer af luftvejs epitelceller giver en unik model af luftvejene eksponering for giftige gasser såsom klor. I dette manuskript beskriver vi effekten af klor eksponering på luft-væske grænsefladen kulturer af epitelceller og nedsænket kultur cardiomyocytes. In vitro eksponering systemer giver vigtige mekanistiske undersøgelser for at evaluere veje, der kunne så bruges til at udvikle nye terapeutiske midler.
Abstract
Cellekulturer er uundværlige til at udvikle og studere effekten af terapeutiske midler, forud for deres anvendelse i dyremodeller. Vi har den unikke evne til at modellere godt differentierede humane luftveje epitel og hjertemuskelceller. Dette kunne være et uvurderligt værktøj til at studere de skadelige virkninger af giftige inhalerede kemikalier, såsom klor, der normalt kan interagere med celleoverflader, og danner forskellige biprodukter ved reaktion med vand, og begrænse deres virkninger i neddykkede kulturer. Vores model ved hjælp af godt differentierede humane luftveje epitelcellekulturer på air-liqiuid brugerflade omgår denne begrænsning samt giver mulighed for at evaluere kritiske mekanismer toksicitet af potentielle giftige inhalerede kemikalier. Vi beskriver øget tab af membran integritet, caspase frigivelse og død over giftige inhaleret kemikalie såsom klor eksponering. I denne artikel foreslår vi metoder til at modellere klor eksponering i pattedyr hjerte og luftveje epithelial calen i kultur og enkle test for at vurdere dens virkning på disse celletyper.
Introduction
Udsættelse for giftige inhalerede kemikalier (tics) / gasser såsom klor (Cl 2) er fortsat en løbende sundhedsmæssig bekymring i utilsigtede eksponeringer såvel som i deres potentielle anvendelse som en kemisk trussel middel. Selv om lungerne er det primære mål, er organer, såsom hjerte og hjerne også påvirket 1-3. In vivo modeller er generelt bruges til toksicitetstestning fra TIC, men in vitro-analyser til vurdering toksicitet er enklere, hurtigere og mere omkostningseffektiv. I vitro modeller giver også mulighed for en omfattende undersøgelse af agent-celle interaktioner, der kan være svære at vurdere in vivo. Sådanne in vitro-eksponering systemer er sjældne og desuden i nogle konventionelle modeller, hvor giftige stoffer der tilsættes til dyrkningsmediet, hvor cellerne er neddykket, kan egenskaberne af de midler ændres på grund af interaktioner og binde til komponenter i mediet. I sådanne scenarier cellekultursystemer såsom luft-væske grænsefladen (ALI) kulturer af primære humane luftveje epitelceller, der foreslås her, som direkte kan udsættes for gasformige agenter kunne være lovende.
Epitelceller, der beklæder luftvejene er de første linjer af forsvar mod inhaleret giftige kemikalier. Den humane luftvejsepitel danner en fysisk barriere mellem lumen og de underliggende celler i lunge og deltager i reaktionen af lungen. Det producerer en række cytokiner og andre pro-og anti-inflammatoriske midler samt udskiller slim / luftvejsoverfladevæske (ASL), der dækker epitel. En af begrænsningerne i konventionelle neddykket in vitro dyrkningssystemer er også, at ASL og slim, der dækker epiteloverfladen fjernes eller fortyndes. Dette afspejler ikke den fysiologiske tilstand af lungeepitelceller, der udsættes for luft. Således bør en ideel in vitro system for afprøvning TIC toksicitet kopiere denne arkitektur. Der er stor interesse i at udvikle en hurtig screening metoder, der kan forudsige in vivo toksicitet. Epitelceller dyrket på ALI differentiere og har godt-opdelte strukturer og funktioner i forhold til celler dyrket neddykket og tjene en overlegen model af luftvejene.
I denne undersøgelse beskriver vi brugen af air-væske-grænsefladen kultur humane luftveje (tracheobronchial) epitelceller for giftige inhalerede gas toksicitet teste og sammenligne det med en neddykket cellekultur af cardiomyocyte dermed studere et andet vigtigt mål for toksicitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mest almindelige type af akut toksiske eksponeringer opstår, når man trækker vejret en giftig kemisk i lungerne. Disse kemikalier kan også hurtigt taget op i blodbanen og kan påvirke andre organer såsom hjerne og hjerte. Giftighed ved indånding af forskellige stoffer med anvendelse af dyremodeller undersøges og rapporteres bredt, men mekanismerne er mindre godt forstået. Dette er en stor forhindring i at udvikle effektive behandlinger. Fravær af in vitro eksponeringssystemer er en primær årsag b…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning er støttet af modvirke Program, National Institutes of Health (NIH), Kontoret for direktøren, og National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) Grant Number U54 ES015678 (CWW). SA er også støttet af børnehospital Colorado / Colorado School of Mines Samarbejde Pilot Award # G0100394 og Børnehospital Colorado Research Institue Pilot Award # G0100471.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa-488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
Riferimenti
- Mohan, A., et al. Acute accidental exposure to chlorine gas: clinical presentation, pulmonary functions and outcomes. Indian J Chest Dis Allied Sci. 52, 149-152 (2010).
- Kose, A., et al. Myocardial infarction, acute ischemic stroke, and hyperglycemia triggered by acute chlorine gas inhalation. Am J Emerg Med. 27, 1021-1024 (2009).
- Das, R., Blanc, P. D. Chlorine gas exposure and the lung: a review. Toxicol Ind Health. 9, 439-455 (1993).
- Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev Biol. 80, 466-482 (1980).
- Ahmad, S., et al. Bcl-2 suppresses sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase expression in cystic fibrosis airways: role in oxidant-mediated cell death. Am J Respir Crit Care Med. 179, 816-826 (2009).
- Ahmad, S., et al. Tissue factor signals airway epithelial basal cell survival via coagulation and protease-activated receptor isoforms 1 and 2. Am J Respir Cell Mol Biol. 48, 94-104 (2013).
- Lam, H. C., et al. Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface. J Vis Exp. (48), (2011).
- Hosokawa, T., et al. Differentiation of tracheal basal cells to ciliated cells and tissue reconstruction on the synthesized basement membrane substratum in vitro. Connect Tissue Res. 48, 9-18 (2007).
- Fulcher, M. L., et al. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. , 107-183 (2005).
- Ahmad, S., et al. SERCA2 regulates non-CF and CF airway epithelial cell response to ozone. PloS One. 6, e10 (2011).
- Martin, J. G., et al. Chlorine-induced injury to the airways in mice. Am J Respir Crit Care Med. 168, 568-574 (2003).
- Evans, R. B. Chlorine: state of the art. Lung. 183, 151-167 (2005).
- Vliet, A., et al. Formation of reactive nitrogen species during peroxidase-catalyzed oxidation of nitrite. A potential additional mechanism of nitric oxide-dependent toxicity. J Biol Chem. 272, 7617-7625 (1997).
- Ahmad, S., et al. Lung epithelial cells release ATP during ozone exposure: signaling for cell survival. Free Radic Biol Med. 39, 213-226 (2005).
- Allen, C. B. An automated system for exposure of cultured cells and other materials to ozone. Inhal Toxicol. 15, 1039-1052 (2003).
