In-vitro-Zellkulturmodell für Toxic Inhalative Chemical Testing
Summary
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Belichtungsverfahren von Zellkulturen zu inhalierenden toxischen Chemikalien zeigen. Exposition der differenzierten Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle (ALI) Kulturen von Epithelzellen der Luftwege bietet eine einzigartige Modell von Atemwegs Exposition gegenüber toxischen Gasen, wie Chlor. In dieser Handschrift beschreiben wir Wirkung von Chlor-Exposition auf die Luft-Flüssigkeits-Grenzkulturen von Epithelzellen und Tauchkultur der Herzmuskelzellen. In-vitro-Belichtungssysteme erlauben wichtige mechanistische Studien, um Wege, die dann genutzt werden, um neue therapeutische Mittel zu entwickeln beurteilen.
Abstract
Zellkulturen sind unverzichtbar für die Entwicklung und Studie die Wirksamkeit von therapeutischen Mitteln, vor ihrem Einsatz in Tiermodellen. Wir haben die einzigartige Fähigkeit, gut differenzierten humanen Atemwegsepithel und Herzmuskelzellen zu modellieren. Dies könnte ein wertvolles Werkzeug, um die schädlichen Wirkungen toxischer inhalierten Chemikalien wie Chlor, die normalerweise mit der Zelloberfläche interagieren, und bilden verschiedene Nebenprodukte bei der Reaktion mit Wasser, und ihren Effekten in Submerskulturen zu studieren. Unser Modell mit gut differenzierten menschlichen Atemwege epithelialen Zellkulturen bei Luft-liqiuid Schnittstelle umgeht diese Beschränkung auf und bietet die Möglichkeit, kritische Mechanismen der Toxizität von möglichen giftigen Chemikalien inhalativen beurteilen. Wir beschreiben eine verbesserte Verlust der Membranintegrität, Caspase Mitteilung und Tod auf toxische chemische inhalativen Exposition wie Chlor. In diesem Artikel schlagen wir Methoden, um Chlor Exposition in Säugetier-Herz und Atemwegsepithelzellen c modellierenEllen in Kultur und einfache Tests, um ihre Wirkung auf diese Zelltypen zu evaluieren.
Introduction
Inhalativen Exposition gegenüber toxischen Chemikalien (TIC) / Gase wie Chlor (Cl 2) bleibt eine laufende Gesundheitsproblem in zufälligen Positionen als auch in ihren möglichen Einsatz als chemische Bedrohung Mittel. Obwohl die Lunge das primäre Ziel sind Organe wie Herz und Gehirn betroffen 1-3. In vivo-Modelle sind in der Regel für die Prüfung Toxizität von TIC verwendet, aber in vitro-Assays zur Beurteilung Toxizität sind einfacher, schneller und kostengünstiger. In vitro-Modellen auch für die umfangreiche Untersuchung von Mittel-Zell-Interaktionen, die schwer zu in vivo zu beurteilen sein kann zu ermöglichen. Wie in vitro-Belichtungssysteme sind selten und außerdem in einigen herkömmlichen Modellen, bei denen giftige Substanzen werden dem Kulturmedium der Zellen hinzugefügt taucht, die Eigenschaften der Mittel kann aufgrund von Wechselwirkungen und die Bindung an Komponenten in dem Medium ändern. In solchen Szenarien Zellkultursystemen, wie Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) Kulturen von primären humanen Epithelzellen der Atemwege, hier vorgeschlagen, die direkt in den gasförmigen Mittel ausgesetzt werden könnte vielversprechend.
Epithelzellen der Atemwege sind die ersten Verteidigungslinien gegen giftige Chemikalien eingeatmet. Der menschliche Luftwegsepithel bildet eine physikalische Barriere zwischen dem Lumen und den darunterliegenden Zellen in der Lunge und nimmt an der Reaktion der Lunge. Es produziert eine Anzahl von Cytokinen und anderen pro-und anti-inflammatorische Mittel sowie Schleim sekretiert / Atemwegsoberflächenflüssigkeit (ASL), die das Epithel. Eine der Einschränkungen bei herkömmlichen in vitro-Kultursystemen untergetaucht ist auch, dass die ASL und Schleim, die Epitheloberfläche Abdeckung entfernt oder verdünnt. Dies entspricht nicht den physiologischen Zustand der Lungen Epithelzellen, die der Luft ausgesetzt sind. Daher sollte ein ideales in vitro-System für die TIC Toxizität dieser Architektur repliziert werden. Es gibt ein großes Interesse an der Entwicklung schnelle Screening methoden, die in vivo-Toxizität vorherzusagen. Epithelzellen an der ALI gewachsen zu differenzieren und haben gut differenzierten Strukturen und Funktionen im Vergleich zu Zellen gewachsen untergetaucht und servieren ein überlegenes Modell der Atemwege.
In dieser Studie beschreiben wir den Einsatz von Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche Kultur der Menschenatemwege (tracheobronchiale) Epithelzellen zum Testen eingeatmeten Giftgastoxizität und vergleichen Sie sie mit einem untergetauchten Zellkultur von Kardiomyozyten, damit das Studium ein weiteres wichtiges Ziel der Toxizität.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die häufigste Form der akuten toxischen Expositionen tritt auf, wenn man eine giftige Chemikalie in die Lunge atmet. Diese Chemikalien können auch schnell in den Blutkreislauf aufgenommen werden und andere Organe wie Herz und Gehirn beeinflussen. Giftigkeit beim Einatmen von verschiedenen Agenten mit Hilfe von Tiermodellen untersucht und darüber berichtet, aber die Mechanismen sind weniger gut verstanden. Dies ist eine große Hürde bei der Entwicklung wirksamer Therapien. Das Fehlen von in-vitro-Belichtungssyste…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wird von der CounterACT Programm, National Institutes of Health (NIH), das Büro des Direktors, und dem National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) Grant Number U54 ES015678 (CWW) unterstützt. SA wird auch von Kinderkrankenhaus Colorado / Colorado School of Mines Collaboration Pilot-Award # G0100394 und Kinderklinik Colorado Forschung Institue Pilot-Award # G0100471 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa-488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
Riferimenti
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