Vi presenterar ett enkelt och effektivt protokoll för generering av humana makrofager. Buffy coats bearbetas av dubbel densitetsgradientcentrifugering och isolerade monocyter därefter differentieras till makrofager i teflonbelagda cellodlingspåsar. Detta maximerar makrofag avkastning och underlättar cellskörd för efterföljande experiment.
Mänskliga makrofager är involverade i en uppsjö av patologiska processer, från infektionssjukdomar till cancer. Alltså de utgör ett värdefullt verktyg för att förstå mekanismerna bakom dessa sjukdomar. Vi presenterar därför ett enkelt protokoll för isolering av humana monocyter från buffy coats, följt av en differentieringsförfarande som resulterar i höga makrofag avkastning. Tekniken bygger till största delen på allmänt tillgängliga labbutrustning och därmed ger ett kostnadseffektivt och tidsbesparande sätt att få stora mängder humana makrofager. I korthet buffy coats från friska blodgivare utsätts för en dubbel densitetsgradientcentrifugering för att skörda monocyter från perifert blod. Dessa monocyter odlas därefter i fluorerade eten-propen (FEP) Teflon-belagda cellodlingspåsar i närvaro av makrofag-kolonistimulerande faktor (M-CSF). De differentierade makrofager lätt kan skördas och användas för efterföljande studier och funktionell somsäger. Viktiga metoder för kvalitetskontroll och validering av isolering och differentieringssteg kommer att belysas i protokollet. Sammanfattningsvis det protokoll som beskrivs här möjliggör för forskare att rutinmässigt och reproducerbart isolera mänskliga makrofager utan behov av kostnadskrävande verktyg. Vidare kan sjukdomsmodeller studeras i en syngen mänskliga systemet kringgår användningen av murina makrofager.
Celler från monocytiska härstamning och deras terminalt differentierade derivat – makrofager – uppvisar en slående plasticitet i avseende på deras biologiska funktion, vilket leder till deras medverkan i så skilda processer som utveckling, vävnad reparera och immunitet 1. Det senare beror på deras fagocytiska och antigenpresenterande förmåga som placerar makrofager i korsningen mellan det medfödda och adaptiva immunsvaret 2. Men deras förmåga utsöndra cytokiner, kemokiner, tillväxtfaktorer och andra signalmolekyler 1 inte bara förstärker deras immunmodulerande funktion, utan också ligger till grund för att de ytterligare funktioner. Försök att spegla dessa olika aktiveringssteg i samband med icke-mikrobiella medierade tillstånd har lett till M1 och M2 kategori 3. Även om denna klassificering är inte komplett, möjliggör det en grundläggande förståelse av makrofager biologi.
På grund av dessa mångfacetterade kapacitet det kommer inte som någon överraskning att makrofager är förknippade med många villkor som på något sätt involverar vävnadsombildning eller inflammation. Bredvid deras grundläggande roll i erkännandet och röjning av invaderande patogener 4-6, har makrofager alltmer kommit i fokus i ateroskleros, fibros, fetma och cancer 7-10. En reproducerbar metod för generering av mänskliga makrofager är därför avgörande för förståelsen av dessa sjukdomar. Här presenterar vi en metod baserad på isoleringen av humana monocyter från perifert blod från friska donatorer genom en dubbel densitetsgradientcentrifugering teknik som beskrivits tidigare 11. För att underlätta differentiering mot makrofager, är de isolerade monocytiska celler inkuberades i närvaro av låga koncentrationer av M-CSF och normalt humant serum 12. För att underlätta vidare hantering och cellskörd, är differentiering utförs i gaspermeabelt FEPTeflon-belagd cellodlingspåsar med en hydrofob yta 12-15. De resulterande vilande makrofager kan utsättas för ett brett spektrum av analyser såsom de fortfarande är i stånd att svara på antingen en M1 eller M2-liknande sätt. Alternativa metoder för monocyt isolering och efterföljande differentiering såsom magnetisk aktiverad cellsortering (MACS) eller motströms centrifugal slamning (CCE) har vissa begränsningar när det gäller avkastning, kostnad och tid som krävs. Protokollet som beskrivs häri erbjuder fördelen att den kan utföras med standardlaboratorieutrustning utan behov av särskilda reagenser (t.ex. MACS magnetiska kulor) eller anordningar (t.ex. CCE apparater) och möjliggör behandling av stora mängder celler.
Makrofager är viktiga effektorceller i det medfödda immunförsvaret och visar viktiga funktioner i immunmodulering, antigenpresentation och vävnad homeostas. På grund av deras märkliga plasticitet, de kan reagera på olika stimuli med förändringar i deras fenotyp. Men än så länge en hel del uppgifter om makrofag polarisering erhållits i murina systemet, även om det finns rapporter som visar att endast omkring 50% av makrofag polarisering markörer kan direkt översättas från mus till människa 16. Därför presenterar vi här ett förfarande för erhållande av primära humana makrofager i tillräckligt antal och renhet utan behov av dyra material, t.ex. MACS magnetiska kulor eller en motströms centrifugal elutriation anordningen.
Vår metod bygger på isolering av monocyter från PBMC och deras senare differentiering till makrofager i FEP teflonbelagd cellodlingspåsar i närvaro av låga concentrations av M-CSF från 11 till 13. Medan monocyter utgör mindre än 5 till 10% av perifert blod leukocyter hos människor, vid stimulering de rekryteras till perifera platser där de differentierar till inhemska vävnadsmakrofager eller dendritiska celler 17. Den cytokin M-CSF är viktigt för monocyt överlevnad och driver deras differentiering till makrofager 18,19. Hittills M-CSF koncentrationer som valts ut för monocyt differentiering varierade upp till 100 ng / ml, men i våra protokoll har vi möjlighet att få tillräckligt antal mogna makrofager med en M-CSF koncentration på endast 2,5 ng / ml 12 , 20. Dessutom celler odlas i FEP Teflon-belagda cellodlingspåsar som underlättar avskiljandet av makrofager och deras senare sådd i definierade cellantal. Eftersom påsarna kan återanvändas flera gånger, denna ytterligare minskar kostnaderna för isoleringsprocessen.
De makrofager erhållna genom detta förfarandeär mycket positiva för CD45, CD14, CD11b, CD11c och visar uttryck av mannosreceptorn CD206, som argumenterar för en population av rena, mogna makrofager 21,22. Särskilt höga CD14 uttryck är typiskt för makrofager differentierade i närvaro av M-CSF 23. Efter sådd av cellerna, uppvisar de en snabb vidhäftning till plastytor med vissa celler visar en typisk spindel-liknande morfologi, medan andra uppvisar ett stekt ägg fenotyp. Detta är i enlighet med de iakttagelser från andra författare 18,22,24.
Det rapporterades att monocyter differentiering i närvaro av M-CSF leder till M2-makrofager polarise 16,25. Men makrofagerna isolerade genom våra protokoll kan fortfarande svara på en rad olika stimuli, inklusive exponering för tumör-cellerna mikrovesiklar samt co-kultur med tumörceller 26,27 eller exponering för LPS som de reagerar med induktion av pro- inflammatoriska gener såsom IL-1 &# 946 ;, TNF, Wnt5a eller olika matrixmetalloproteinaser som anses typiska för M1-makrofager polarise 3,5,28.
Sammanfattningsvis isolering av monocyter genom dubbel densitetsgradientcentrifugering och efterföljande differentiering mot makrofager i FEP Teflon-belagda cellodlingspåsar resulterar i höga antal av makrofager utan behov av tekniskt svåra eller kostsamma förfaranden. De erhållna makrofager kan användas för efterföljande analys som sträcker sig från klassiskt aktivering genom LPS i samodling med tumörceller.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Mrs Meike Schaffrinski för hennes alltid utmärkt tekniskt stöd under de senaste åren.
Detta arbete har finansierats genom den tyska forskningsrådet (DFG) inom den gemensamma forskargruppen 942 (FOR942) och genom forskningsprogrammet Medicinska fakulteten, Georg-August-universitetet Göttingen.
antibodies for immunophenotyping | Beckman Coulter | for example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795) | |
BioLegends | for example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105) | ||
Axiovert 200M microscope | Zeiss | ||
calcein-AM | AnaSpec | 89201 | |
combi-stopper closing cones | Braun | 4495101 | |
1x PBS, w/o Ca and Mg | Pan biotech | P04-36500 | for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0,5 M EDTA per 500ml PBS |
10x PBS, w/o Ca and Mg | Invitrogen | 14200-067 | |
EDTA (Titriplex III) | Merck | 1084211000 | prepare a 0,5 M solution in H2O, use a sterile filter |
cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based) | Gibco | 13151-014 | |
Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 10091148 | heat-inactivated |
Ficoll (density 1.077g/ml) | Biochrom AG | L6115 | |
FACSCanto II | BD Biosciences | ||
goat anti-mouse FITC | santa cruz | sc-2010 | |
LPS from E.coli | Sigma | L8274 | final conc: 100 ng/ml |
Multifuge 3 L-R | Heraeus | ||
Penicillin/streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
Percoll (density 1,131g/ml) | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
Perfusor syringe 50ml | Braun | 8728844F | |
Phalloidin-TRITC | Sigma | P1951 | resuspend in methanol (c = 0,1 mg/ml) |
Plastic Disposable Pasteur Pipettes | LVL technologies | 2655181 | |
rh M-CSF | ImmunoTools | 11343117 | Resuspend in 500µl sterile H2O (c = 100 ng/µl), aliquot |
RPMI-1640 with Phenol Red | Gibco | 21875-034 | |
RPMI-1640 without Phenol Red | Gibco | 11835-063 | |
sterilization paper | VP group | 3KFKFS230116 | |
Trypan Blue stain (0,4% w/v) | Sigma | T8154 | |
FEP Teflon-coated cell culture bag, small | CellGenix | 72-C | |
FEP Teflon-coated cell culture bag, large | CellGenix | 197-C |