Akut Brain Trauma i Mus Efterfulgt af Longitudinal To-foton Imaging
Summary
Akut hjerne traume er en alvorlig skade, der ikke har tilstrækkelig behandling til dato. Multifoton mikroskopi tillader at studere længderetningen processen akut hjernelæsion udvikling og sondering terapeutiske strategier i gnavere. To modeller af akut hjerne traumer undersøgt med in vivo to-foton billeddannelse af hjernen er påvist i denne protokol.
Abstract
Selv akut hjerne traumer ofte skyldes hoved skade i forskellige ulykker og påvirker en væsentlig del af befolkningen, er der ingen effektiv behandling for det endnu. Begrænsninger af tiden anvendte dyremodeller hindre forståelse af patologien mekanisme. Multifoton mikroskopi tillader at studere celler og væv i intakte dyrehjerner længderetningen under fysiologiske og patologiske tilstande. Her beskriver vi to modeller af akut hjerneskade undersøgt ved hjælp af to-foton-billeddannelse af hjernen celle adfærd under posttraumatisk forhold. Et udvalgt område af hjernen er skadet med en skarp kanyle til at producere et traume af en kontrolleret bredde og dybde i hjernen parenkym. Vores metode anvender stereotaktisk prik med en kanyle, som kan kombineres med samtidig lægemiddeltilførsel. Vi foreslår, at denne fremgangsmåde kan anvendes som et avanceret værktøj til at studere cellulære mekanismer patofysiologiske konsekvenser af akut traume i pattedyrs hjerne <em> In vivo. I denne video, kombinerer vi akut hjerneskade med to præparater: kraniel vindue og kraniet udtynding. Vi har også diskutere fordele og begrænsninger ved begge forberedelserne til multisession billeddannelse af hjernens regenerering efter traumer.
Introduction
Akut hjerneskade er et væsentligt folkesundhedsproblem med høj forekomst af skade i motorkøretøj går ned, falder eller overfald, og høj forekomst af efterfølgende kronisk handicap. Terapeutiske metoder til behandling af hjerneskade forblive helt symptomatisk, hvilket begrænser effektiviteten af præhospitale, kirurgisk og intensivbehandling. Dette gør de sociale og økonomiske konsekvenser af hjerneskade særligt alvorlige. Af forskellige årsager, mislykkedes de fleste af de kliniske forsøg for at dokumentere en forbedring i bedring efter hjerneskade ved hjælp nye terapeutiske tilgange.
Dyremodeller er afgørende for at udvikle nye terapeutiske strategier over for en fase, hvor lægemiddeleffektivitet kan forudsiges hos patienter med hjerneskader. På nuværende tidspunkt flere veletablerede dyremodeller for hovedtraume findes, herunder kontrolleret kortikal effekt 1, væske slagtøj skade 2, dynamisk kortikal deformation 3, vægt-drop4 og foto skade 5.. En række af eksperimentelle modeller er blevet anvendt til at undersøge visse morfologiske, molekylære og adfærdsmæssige aspekter af hovedtraume patologi. Men intet dyremodel er helt vellykket i validere nye terapeutiske strategier. Udvikling af pålidelige, reproducerbare og kontrolleres dyremodeller af hjerneskade er nødvendigt at vurdere de komplekse patologiske processer.
Den ny kombination af de nyeste mikroskopiske imaging teknologier og genetisk kodede fluorescerende reportere giver en hidtil uset mulighed for at undersøge alle faser af hjerneskade, som omfatter primær skade, spredning af den primære skade, sekundær skade, og regeneration. Især in vivo to-foton mikroskopi er en unik lineær optisk teknologi, der tillader visualisering i realtid af cellulære og endda subcellulære strukturer i dybe corticale lag gnaverhjerne. Flere typer af celler og orgaNelles kan afbildes samtidigt ved at kombinere forskellige fluorescerende markører. Ved hjælp af dette kraftfulde værktøj, vi kan visualisere dynamiske morfologiske og funktionelle ændringer i levende hjerne under posttraumatisk forhold. Fordelene ved in vivo to-foton mikroskopi i at studere hjerneskade blev for nylig demonstreret af Kirov og kolleger 6. Ved hjælp af en mild fokal kortikale kontusion model viste disse forfattere, at akut dendritiske skade i pericontusional cortex gates af nedgangen i den lokale blodgennemstrømning. Desuden har de vist, at metabolisk kompromitteret cortex omkring blodudtraedning webstedet er yderligere beskadiget af spredning depolarisering. Denne sekundære skader påvirker synaptiske kredsløb, hvilket gør konsekvenserne af traumatisk hjerneskade mere alvorlige.
Her foreslår vi metoden til stereotaktisk pik med en sprøjte nål, der kunne kombineres med samtidig aktuelt drug applikation, som en avanceret model for lokale hjerneskade og som et redskab til at studere patofysiologiske konsekvenser af akut traume i pattedyrs hjerne in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hjernelæsion er en brat, uforudsigelig begivenhed. Her beskriver vi dyremodel, der gengiver et spektrum af patologiske ændringer, der observeres i humane patienter efter hjerneskade, såsom neurodegeneration, eliminering af dendritter, hjerneødem, glial ar, blødninger i hjernebarken kombineret med fokal subaraknoidal blødning og øget permeabilitet af blod-hjerne-barrieren. At studere primær og sekundær patogenese, samt bedring efter traumer, var denne skade model kombineret med langsgående in vivo visu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er dybt taknemmelige for Dr. Frank Kirchhoff for at levere GFAP-EGFP og CX3CR1-EGFP musestammer. Arbejdet blev støttet af tilskud fra Center for International mobilitet Finland, Tekes, finsk Graduate School of Neuroscience (FGSN) og Finlands Akademi.
Materials
| 2A-sa dumb Tweezers, 115mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30G ½’’ needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eyes-ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micro motor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Micro dressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 microliter | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5×5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
Riferimenti
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model. J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Lindgren, S., Rinder, L. Experimental studies in head injury. Biophysik. 2 (5), 320-329 (1965).
- Shreiber, D. I., et al. Experimental investigation of cerebral contusion: histopathological and immunohistochemical evaluation of dynamic cortical deformation. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (2), 153-164 (1999).
- Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Res. 211 (1), 67-77 (1981).
- Bardehle, S., et al. Live imaging of astrocyte responses to acute injury reveals selective juxtavascular proliferation. Nat. Neurosci. 16 (5), 580-586 (2013).
- Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Nolte, C., et al. GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue. Glia. 33 (1), 72-86 (2001).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1 (1), 31-37 (2004).
- Carré, E., et al. Technical aspects of an impact acceleration traumatic brain injury rat model with potential suitability for both microdialysis and PtiO2 monitoring. J. Neurosci. Methods. 140, 23-28 (2004).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat. Protoc. 5, 201-208 (2010).
- Cianchetti, F. A., Kim, D. H., Dimiduk, S., Nishimura, N., Schaffer, C. B. Stimulus-evoked calcium transients in somatosensory cortex are temporarily inhibited by a nearby microhemorrhage. PloS one. 8 (5), (2013).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J. Vis. Exp. 61, (2012).
