qPCR הוא שיטה רגישה ומהירה לאיתור של Cytomegaloviral DNA בקבועה פורמלין, רקמות ביופסיה מוטבעות פרפין
Summary
This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.
Abstract
זה חיוני כדי לזהות זיהום ציטומגלווירוס (CMV) במערכת העיכול (GI) בדרכי של חולי immunosuppressed, בהתחשב בסיכון גבוה יותר שלהם לפיתוח זיהום חמור. שיטות מעבדה רבות לזיהוי של זיהום CMV פותחו, כולל סרולוגיה, תרבות נגיפית, ושיטות מולקולריות. לעתים קרובות, שיטות אלו משקפות את מעורבות מערכתית עם CMV ולא באופן ספציפי לזהות מעורבות רקמות מקומית. לכן, זיהוי של זיהום CMV במערכת העיכול הוא לעתים קרובות נעשה על ידי היסטולוגיה המסורתית של רקמת ביופסיה. מכתים Hematoxylin ו eosin (H & E) בשיתוף עם אימונוהיסטוכימיה (IHC) נשאר מעמודי התווך של בדיקת ביופסיה אלה. H & E וIHC לפעמים לגרום לדפוסי מכתים לא טיפוסיים (דו משמעיים), מה שהופך את הפרשנות קשה. זה היה הראה כי תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR) לCMV יכולה להתבצע בהצלחה על, רקמת ביופסיה (FFPE) מוטבע פרפין קבוע פורמלין למאודרגישות גבוהה וספציפיות. המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לבצע בדיקות qPCR לגילוי CMV ברקמת הביופסיה FFPE במעבדת הגדרה קלינית. שיטה זו עשויה להיות יתרון גדול עבור חולים במקרים של כתמים חד משמעיים לCMV בביופסיות במערכת העיכול.
Introduction
הפרשנות של זיהום ציטומגלווירוס (CMV) בדגימות קליניות חשובה באופן קריטי. CMV הוא חבר בתת משפחת betaherpesvirinae של הרפס. דומה להרפס אחר, יש CMV היכולת להקים זיהום מתמשך או סמוי מאופיינת בחוסר השכפול נגיפי פעיל 1. הפעלה מחדש של נגיף עלולה להתרחש בזמנים של לחץ או דיכוי חיסוני אחר, מה שמוביל לשכפול נגיפי פעיל מאופיין בשחרור virion, אשר עשוי להיות מלווה בגילויי מחלה 2-4. במערכת העיכול (GI) תסמיני המחלה CMV בתדירות גבוהה כוללים כאבי בטן ו / או צואה דמה 1.
האבחנה של גסטרואנטריטיס CMV ידי היסטולוגיה מנצלת hematoxylin ו eosin (H & E) לזהות תכלילים נגיפיים CMV. במקרים בהם חשד קליני גבוהה עדיין אין תכלילים ברורים הם נצפו, אימונוהיסטוכימיה (IHC) משמשת לעתים קרובות כשיטת בדיקה נלווית. עם זאת, IHCיכול גם להיות הקשתה על ידי דפוסים נדירים לא קלאסיים המופיעים כתמים סלולריים (דו משמעיים), מה שהופך את הפרשנות קשה (איור 2) 5. הוא ביקש להשתמש DNA שנלקח קבוע פורמלין, פרפין, מוטבע (FFPE) רקמת ביופסיה במערכת העיכול ותגובה הכמותית פולימראז שרשרת (qPCR) כדי לזהות CMV בביופסיות במערכת העיכול. טכניקה זו הוכח להיות בעל ערך בזיהוי של CMV בביופסיות במערכת העיכול, ומועילה במיוחד במקרים מכתים IHC המשמעיים 5,6. כמו כן, qPCR גם הוכח לתאם גם עם נתוני בדיקה נוספים קליניים CMV כאשר הוא זמין 6. שימוש בqPCR באיתור CMV עלול להוביל לאבחון מוקדם וטיפול במקרים בהם חשד קליני לCMV הוא גבוה, אבל H & E ו-CMV IHC הוא שליליים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטות מעבדה רבות זמינות עבור האבחנה של זיהום ציטומגלווירוס (CMV), כולל סרולוגיה, תרבות נגיפית, מבחני ירמיה מולקולריים, היסטולוגיה של חומר ביופסיה, וכפי שהוכיח לאחרונה מבחני, מולקולריים של, ביופסיה קבועה פורמלין פרפין, מוטבע (FFPE) 5,6 רקמות. סרולוגיה, ברגע שעמוד תווך ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים את איימי Thomasson על סיועה בהכנת כתב היד הזה, ופרדריק Skarstedt וריאן כריסטי על מאמציהם בהכנה של דמויות.
Materials
| 1.7 mL microfuge tubes | Costar | 3620 | |
| serrated forceps | Electron Microscopy Services | 62086-1S | Micro Forceps MF-1 |
| Tabletop centrifuges (microfuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 gallon |
| Ethanol | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| microtome | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Supplement Kit | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler centrifuge | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Cooling Block | Roche | 10800058001 | |
| LightCycler Capping Tool | Roche | 3357317 | |
| Color Compensation Kit | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μL Capillaries | Roche | 1 909 339 | |
| blades | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge low profile |
Riferimenti
- Hodinka, R. L. . Manual of Clnical Microbiology. 2, 1558-1574 (2011).
- Lasry, S., et al. Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers. The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).
- Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers. JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).
- Pass, R. F., et al. Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection. The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).
- McCoy, M. H., et al. qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies. Human Pathology. 45, 48-53 (2014).
- Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).
- Krech, U. Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world. Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).
- Chou, S. Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection. Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).
- Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections. Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).
- Revello, M. G., et al. Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy. The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).
- Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease. The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).
