QPCR هو أسلوب حساس وسريع للكشف عن الحمض النووي من Cytomegaloviral في الفورمالين الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين-الأنسجة خزعة
Summary
This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.
Abstract
لا بد من تحديد الفيروس المضخم للخلايا (CMV) العدوى في الجهاز الهضمي (GI) المسالك المرضى كبت المناعة، نظرا خطر أكبر لتطوير عدوى حادة. وقد تم تطوير العديد من الأساليب المختبرية للكشف عن عدوى الفيروس المضخم للخلايا، بما في ذلك الأمصال والثقافة الفيروسية، والأساليب الجزيئية. في كثير من الأحيان، وهذه الأساليب تعكس الجهازية مع CMV ولا تعرف على وجه التحديد إشراك النسيج المحلية. لذلك، كثيرا ما يتم اكتشاف العدوى CMV في الجهاز الهضمي عن طريق الأنسجة التقليدية من الأنسجة الخزعة. ظلت الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ بالتزامن مع المناعية (IHC) الدعائم الأساسية لدراسة هذه الخزعات. H & E وIHC يؤدي في بعض الأحيان في غير نمطية (ملتبسة) أنماط تلطيخ، مما يجعل من الصعب تفسير. فقد تبين أن كمية البلمرة سلسلة من ردود الفعل (QPCR) لCMV يمكن أن يؤديها بنجاح على الفورمالين الثابتة، (FFPE) جزءا لا يتجزأ من البارافين الأنسجة خزعة للغايةحساسية عالية وخصوصية. الهدف من هذا البروتوكول هو لشرح كيفية أداء الاختبار QPCR للكشف عن الفيروس المضخم للخلايا في الأنسجة خزعة FFPE في إعداد مختبر السريرية. ومن المرجح أن تكون ذات فائدة كبيرة للمرضى في حالات ملتبسة لتلطيخ CMV في الخزعات GI هذا الأسلوب.
Introduction
تفسير الفيروس المضخم للخلايا (CMV) إصابة في العينات السريرية أمر بالغ الأهمية. CMV هو عضو من فصيلة betaherpesvirinae من فيروس الهربس. مماثلة لفيروس الهربس الأخرى، CMV لديه القدرة على إقامة العدوى المستمرة أو الكامنة التي تتميز نقص تكاثر الفيروس النشط 1. قد يحدث تنشيط الفيروس اثناء اوقات التوتر أو كبت المناعة الأخرى، مما يؤدي إلى تكاثر الفيروس النشطة التي تتميز الإفراج الفيريون، والتي قد تترافق مع مظاهر المرض 2-4. في كثير من الأحيان تشمل الجهاز الهضمي (GI) أعراض المرض CMV آلام في البطن و / أو براز دموي 1.
تشخيص التهاب المعدة والأمعاء CMV بواسطة الأنسجة يستخدم الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) لتحديد CMV الادراج الفيروسية. في الحالات التي يتم فيها عالية بعد لم يلاحظ أي شوائب واضحة الاشتباه السريري، وكثيرا ما يستخدم المناعية (IHC) باعتبارها طريقة الاختبار مساعد. ومع ذلك، IHCويمكن أيضا أن يعوقها غير الكلاسيكية التي تظهر أنماط تلطيخ الخلوية نادرة (ملتبسة)، مما يجعل من الصعب تفسير (الشكل 2) 5. وقد سعى إلى استخدام الحمض النووي المستخرج من الفورمالين الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) الأنسجة خزعة GI والكمية البلمرة سلسلة من ردود الفعل (QPCR) للكشف عن الفيروس المضخم للخلايا في الخزعات GI. وقد تبين هذه التقنية لتكون ذات قيمة في الكشف عن الفيروس المضخم للخلايا في الخزعات GI، ومفيد خاصة في حالات ملتبسة تلطيخ IHC 5،6. أيضا، كما ثبت QPCR أنها تتطابق جيدا مع إضافية السريرية CMV اختبار البيانات عندما كان متوفرا 6. استخدام QPCR في الكشف عن الفيروس المضخم للخلايا قد تؤدي إلى التشخيص المبكر والعلاج في الحالات التي الاشتباه السريري لCMV عالية، ولكن H & E وCMV IHC سلبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
العديد من الأساليب المختبرية المتاحة لتشخيص الفيروس المضخم للخلايا (CMV) العدوى، بما في ذلك الأمصال والثقافة الفيروسية، المقايسات افيروس الجزيئية، وعلم الأنسجة خزعة من المواد، وكما تجلى مؤخرا، المقايسات الجزيئية، (FFPE) خزعة الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعترف ايمي توماسون للحصول على المساعدة لها مع إعداد هذه المخطوطة، وفريدريك Skarstedt وريان كريستي لما بذلوه من جهود في إعداد الأرقام.
Materials
| 1.7 mL microfuge tubes | Costar | 3620 | |
| serrated forceps | Electron Microscopy Services | 62086-1S | Micro Forceps MF-1 |
| Tabletop centrifuges (microfuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 gallon |
| Ethanol | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| microtome | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Supplement Kit | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler centrifuge | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Cooling Block | Roche | 10800058001 | |
| LightCycler Capping Tool | Roche | 3357317 | |
| Color Compensation Kit | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μL Capillaries | Roche | 1 909 339 | |
| blades | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge low profile |
Riferimenti
- Hodinka, R. L. . Manual of Clnical Microbiology. 2, 1558-1574 (2011).
- Lasry, S., et al. Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers. The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).
- Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers. JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).
- Pass, R. F., et al. Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection. The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).
- McCoy, M. H., et al. qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies. Human Pathology. 45, 48-53 (2014).
- Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).
- Krech, U. Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world. Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).
- Chou, S. Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection. Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).
- Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections. Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).
- Revello, M. G., et al. Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy. The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).
- Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease. The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).
