qPCR er en følsom og hurtig metode til påvisning af Cytomegaloviral DNA i formalin-faste, paraffinindstøbt biopsivæv
Summary
This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.
Abstract
Det er afgørende at identificere cytomegalovirus (CMV)-infektion i den gastrointestinale (GI) kanal af immunsupprimerede patienter, på grund af deres større risiko for at udvikle alvorlig infektion. Der er udviklet mange laboratoriemetoder til påvisning af CMV-infektion, herunder serologi, viral kultur og molekylære metoder. Ofte er disse metoder afspejler systemisk involvering med CMV og ikke specifikt identificere lokale væv involvering. Derfor er detektion af CMV-infektion i mavetarmkanalen ofte gøres ved traditionel histologi biopsivæv. Hematoxylin og eosin (H & E) farvning i forbindelse med immunhistokemisk (IHC) have været grundpillerne i behandlingen af disse biopsier. H & E og IHC undertiden resultere i atypiske (tvetydige) farvningsmønstre, hvilket gør tolkningen vanskelig. Det blev vist, at kvantitativ polymerase chain reaction (qPCR) for CMV held kan udføres på formalin-fikseret, paraffinindstøbt (FFPE) biopsi væv for megethøj følsomhed og specificitet. Målet med denne protokol er at demonstrere, hvordan du udfører qPCR test til påvisning af CMV i FFPE biopsi væv i et klinisk laboratorium indstilling. Denne metode vil sandsynligvis være til stor gavn for patienter i tilfælde af tvetydige farvning for CMV i GI biopsier.
Introduction
Fortolkning af cytomegalovirus (CMV) infektioner i kliniske prøver er kritisk vigtigt. CMV er et medlem af betaherpesvirinae underfamilie af herpesvirus. I lighed med andre herpesvira, CMV har evnen til at etablere vedvarende eller latent infektion er kendetegnet ved en mangel på aktiv viral replikation 1. Reaktivering af virus kan forekomme i perioder med stress eller anden immunosuppression, hvilket fører til aktiv viral replikation præget af virion udgivelse, som kan være ledsaget af sygdomsmanifestationer 2-4. Gastrointestinal (GI) CMV sygdomssymptomer omfatter ofte mavesmerter og / eller blodig afføring 1.
Diagnosen CMV gastroenteritis ved histologi udnytter hematoxylin og eosin (H & E) for at identificere CMV virale inklusioner. I tilfælde, hvor den kliniske mistanke er høj endnu ingen oplagte inklusioner er observeret, er immunhistokemisk (IHC) ofte brugt som et supplement testmetode. Men IHCkan også være hæmmet af sjældne ikke-klassiske optræder cellulær farvningsmønstre (tvetydige), hvilket gør tolkningen vanskelig (figur 2) 5. Det blev forsøgt at anvende DNA ekstraheret fra formalin-fikseret, paraffinindstøbt (FFPE) GI biopsi væv og kvantitativ polymerase chain reaction (qPCR) for at påvise CMV i GI biopsier. Denne teknik har vist sig at være værdifuld til påvisning af CMV i GI biopsier, og er især nyttigt i tvetydige ICH farvede sager 5,6. Desuden har qPCR også blevet vist at korrelere godt med yderligere kliniske CMV test data, når det er tilgængeligt 6. Brug af qPCR i at opdage CMV kan føre til tidligere diagnosticering og behandling i tilfælde, hvor klinisk mistanke for CMV er høj, men H & E og CMV IHC er negative.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mange laboratoriemæssige metoder er til rådighed til diagnose af cytomegalovirus (CMV) infektion, herunder serologi, viral kultur, molekylær viræmi analyser, histologi af biopsi materiale, og som for nylig demonstreret, molekylære analyser af formalin-fikseret, paraffinindstøbt (FFPE) biopsi væv 5,6. Serologi, når en grundpille i diagnose, kun pålideligt identificerer eksponering og ikke korrelerer godt med akut CMV-infektion 7. Viral kultur, både konventionelle og tidlig antigen skalmedi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender Amy Thomasson for hendes hjælp med at forberede dette manuskript, og Fredrik Skarstedt og Ryan Christy for deres indsats i forberedelsen af figurer.
Materials
| 1.7 mL microfuge tubes | Costar | 3620 | |
| serrated forceps | Electron Microscopy Services | 62086-1S | Micro Forceps MF-1 |
| Tabletop centrifuges (microfuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 gallon |
| Ethanol | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| microtome | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Supplement Kit | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler centrifuge | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Cooling Block | Roche | 10800058001 | |
| LightCycler Capping Tool | Roche | 3357317 | |
| Color Compensation Kit | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μL Capillaries | Roche | 1 909 339 | |
| blades | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge low profile |
Riferimenti
- Hodinka, R. L. . Manual of Clnical Microbiology. 2, 1558-1574 (2011).
- Lasry, S., et al. Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers. The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).
- Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers. JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).
- Pass, R. F., et al. Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection. The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).
- McCoy, M. H., et al. qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies. Human Pathology. 45, 48-53 (2014).
- Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).
- Krech, U. Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world. Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).
- Chou, S. Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection. Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).
- Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections. Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).
- Revello, M. G., et al. Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy. The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).
- Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease. The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).
