qPCR è un metodo sensibile e rapido per il rilevamento del DNA Cytomegaloviral in fissato in formalina, incluse in paraffina biopsia
Summary
This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.
Abstract
E 'fondamentale individuare citomegalovirus (CMV) nel tratto gastrointestinale (GI) dei pazienti immunodepressi, data la loro maggior rischio di sviluppare infezioni gravi. Sono stati sviluppati molti metodi di laboratorio per la rilevazione di infezione da CMV, compresa sierologia, coltura virale, e metodi molecolari. Spesso, questi metodi riflettono coinvolgimento sistemico con CMV e non individuano il coinvolgimento del tessuto locale. Pertanto, il rilevamento di infezione da CMV nel tratto GI è spesso fatto da istologia tradizionale di tessuto bioptico. Ematossilina e eosina (H & E) colorazione in combinato disposto con l'immunoistochimica (IHC) sono rimasti i pilastri di esaminare tali biopsie. H & E e IHC volte provocano atipici (equivoci) pattern di colorazione, rendendo difficile l'interpretazione. E 'stato dimostrato che polymerase chain reaction quantitativa (qPCR) per CMV può correttamente essere eseguita su fissato in formalina, biopsia dei tessuti inclusi in paraffina (FFPE) per moltoalta sensibilità e specificità. L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare come eseguire il test qPCR per la rilevazione di CMV nella biopsia del tessuto FFPE in un ambiente di laboratorio clinico. Questo metodo è probabile che sia di grande beneficio per i pazienti in caso di colorazione equivoca di CMV in biopsie di GI.
Introduction
Interpretazione del citomegalovirus (CMV) in campioni clinici è estremamente importante. CMV è un membro della sottofamiglia Betaherpesvirinae degli herpesvirus. Analogamente agli altri herpesvirus, CMV ha la capacità di stabilire infezione persistente o latente caratterizzata da una mancanza di replicazione virale attiva 1. La riattivazione del virus può verificarsi durante periodi di stress o di altro immunosoppressione, che porta alla replicazione virale attiva caratterizzata dal rilascio di virioni, che può essere accompagnata da manifestazioni di malattia 2-4. Gastrointestinale (GI) sintomi di malattia CMV spesso includono dolore addominale e / o feci sanguinolente 1.
La diagnosi di CMV gastroenterite da istologia utilizza ematossilina ed eosina (H & E) per identificare inclusioni virali CMV. Nei casi in cui è alta ancora presenti inclusioni evidenti si osservano sospetto clinico, immunoistochimica (IHC) è spesso utilizzato come metodo di prova aggiunto. Tuttavia, IHCpuò anche essere ostacolata da figuranti pattern di colorazione cellulare non classici rare (equivoci), rendendo difficile interpretazione (Figura 2) 5. Si è cercato di utilizzare il DNA estratto da fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) tessuti GI biopsia e quantitativa reazione a catena della polimerasi (qPCR) per rilevare CMV in biopsie di GI. Questa tecnica ha dimostrato di essere utile nel rilevamento di CMV in biopsie GI, ed è particolarmente utile in casi di colorazione IHC equivoci 5,6. Inoltre, qPCR ha anche dimostrato di correlare bene con l'aggiunta di dati di test clinici CMV quando è disponibile 6. L'uso di qPCR nel rilevare CMV può portare a diagnosi precoce e il trattamento in caso di sospetto clinico per CMV è alto, ma H & E e CMV IHC sono negativi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Molti metodi di laboratorio sono disponibili per la diagnosi di citomegalovirus (CMV), tra cui la sierologia, coltura virale, saggi viremia molecolare, istologia del materiale bioptico, e, come recentemente dimostrato, saggi molecolari di fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) biopsia 5,6 tessuto. Sierologia, una volta che un pilastro della diagnosi, identifica solo in modo affidabile l'esposizione e non si correla bene con acuta infezione da CMV 7. Cultura virale, sia convenzionali …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo Amy Thomasson per la sua assistenza con la preparazione di questo manoscritto, e Fredrik Skarstedt e Ryan Christy per i loro sforzi nella preparazione di figure.
Materials
| 1.7 mL microfuge tubes | Costar | 3620 | |
| serrated forceps | Electron Microscopy Services | 62086-1S | Micro Forceps MF-1 |
| Tabletop centrifuges (microfuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 gallon |
| Ethanol | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| microtome | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Supplement Kit | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler centrifuge | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Cooling Block | Roche | 10800058001 | |
| LightCycler Capping Tool | Roche | 3357317 | |
| Color Compensation Kit | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μL Capillaries | Roche | 1 909 339 | |
| blades | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge low profile |
Riferimenti
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