qPCR är en känslig och snabb metod för detektion av Cytomegaloviral DNA i formalinfixerade, paraffininbäddade Biopsi Tissue
Summary
This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.
Abstract
Det är viktigt att identifiera cytomegalovirus (CMV) infektion i mag (GI) tarmkanalen av patienter med nedsatt immunförsvar, med tanke på deras större risk att utveckla allvarlig infektion. Många laboratoriemetoder för detektion av CMV-infektion har utvecklats, inklusive serologi, virusodling, och molekylära metoder. Ofta är dessa metoder avspeglar systemiskt engagemang med CMV och inte specifikt identifierar lokal vävnads engagemang. Därför är detektion av CMV-infektion i mag-tarmkanalen som ofta görs av traditionella histologi av biopsivävnad. Hematoxylin och eosin (H & E) färgning tillsammans med immunohistokemi (IHC) har varit stöttepelarna för att undersöka dessa biopsier. H & E och IHC ibland leda till atypiska (tvetydiga) färgningsmönster, vilket gör tolkningen svår. Det visade sig att kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) för CMV med framgång kan utföras på formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) biopsi vävnad för myckethög känslighet och specificitet. Målet med detta protokoll är att visa hur man utför qPCR tester för påvisande av CMV i FFPE biopsi vävnad i en klinisk laboratoriemiljö. Denna metod kommer sannolikt att vara till stor nytta för patienterna vid tvetydiga färgning för CMV i GI biopsier.
Introduction
Tolkning av cytomegalovirus (CMV) infektion i kliniska prover är mycket viktigt. CMV är en medlem av betaherpesvirinae underfamiljen av herpesvirus. I likhet med andra herpesvirus, har CMV förmågan att etablera persistent eller latent infektion kännetecknas av brist på aktiv virusreplikation 1. Reaktivering av virus kan ske under tider av stress eller annan immunsuppression, vilket leder till aktiv virusreplikation präglas av virus release, vilket kan åtföljas av sjukdomsmanifestationer 2-4. Gastrointestinal (GI) CMV-sjukdom symtom är ofta buksmärtor och / eller blodig avföring 1.
Diagnosen CMV gastroenterit genom histologi utnyttjar hematoxylin och eosin (H & E) för att identifiera CMV-virus-inneslutningar. I de fall klinisk misstanke är hög ännu inga tydliga inneslutningar observeras, är immunohistokemi (IHC) används ofta som ett komplement testmetod. Men IHCkan också hämmas av sällsynta icke-klassiska före cellulära färgningsmönster (tvetydiga), vilket gör tolkningen svår (figur 2) 5. Man försökte använda DNA extraherat från formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) GI biopsi vävnad och kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) för att upptäcka CMV i GI biopsier. Denna teknik har visat sig vara värdefulla i upptäckten av CMV i GI biopsier, och är särskilt användbart i tvetydiga IHC färgnings fall 5,6. Dessutom har qPCR också visat sig korrelera väl med ytterligare klinisk CMV testdata när den är tillgänglig 6. Användning av qPCR att upptäcka CMV kan leda till tidigare diagnos och behandling i de fall klinisk misstanke för CMV är hög, men H & E och CMV IHC är negativa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Många laboratoriemetoder finns tillgängliga för diagnos av cytomegalovirus (CMV) infektion, inklusive serologi, virusodling, molekylära viremi analyser, histologi av biopsimaterial, och, som nyligen visat, molekylära analyser av formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) biopsi vävnad 5,6. Serologi, en gång en stöttepelare i diagnos, identifierar endast pålitligt exponering och inte korrelerar väl med akut CMV-infektion 7. Viral kultur, både konventionella och tidiga antigen skal flaska…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner Amy Thomasson för hennes hjälp med att förbereda detta manuskript, och Fredrik Skarstedt och Ryan Christy för deras insatser i utarbetandet av siffror.
Materials
| 1.7 mL microfuge tubes | Costar | 3620 | |
| serrated forceps | Electron Microscopy Services | 62086-1S | Micro Forceps MF-1 |
| Tabletop centrifuges (microfuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 gallon |
| Ethanol | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| microtome | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Supplement Kit | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler centrifuge | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Cooling Block | Roche | 10800058001 | |
| LightCycler Capping Tool | Roche | 3357317 | |
| Color Compensation Kit | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μL Capillaries | Roche | 1 909 339 | |
| blades | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge low profile |
Riferimenti
- Hodinka, R. L. . Manual of Clnical Microbiology. 2, 1558-1574 (2011).
- Lasry, S., et al. Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers. The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).
- Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers. JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).
- Pass, R. F., et al. Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection. The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).
- McCoy, M. H., et al. qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies. Human Pathology. 45, 48-53 (2014).
- Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).
- Krech, U. Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world. Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).
- Chou, S. Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection. Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).
- Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections. Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).
- Revello, M. G., et al. Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy. The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).
- Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease. The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).
