Proteolytisk aktivering af epithelial natrium-kanal (ENAC) heterologt udtrykt i Xenopus laevis-oocytter kan påvises ved at kombinere de aktuelle målinger med en biotinylering fremgangsmåde til at undersøge forekomsten af ionkanal spaltningsprodukter på celleoverfladen. Funktionelt vigtige spaltningssteder kan identificeres ved hjælp af steddirigeret mutagenese.
The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. In combination with site-directed mutagenesis, this approach provides a powerful tool to identify functionally relevant cleavage sites. Proteolytic activation is a characteristic feature of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel (ENaC). The final activating step involves cleavage of the channel’s γ-subunit in a critical region potentially targeted by several proteases including chymotrypsin and plasmin. To determine the stimulatory effect of these serine proteases on ENaC, the amiloride-sensitive whole-cell current (ΔIami) was measured twice in the same oocyte before and after exposure to the protease using the two-electrode voltage-clamp technique. In parallel to the electrophysiological experiments, a biotinylation approach was used to monitor the appearance of γENaC cleavage fragments at the cell surface. Using the methods described, it was demonstrated that the time course of proteolytic activation of ENaC-mediated whole-cell currents correlates with the appearance of a γENaC cleavage product at the cell surface. These results suggest a causal link between channel cleavage and channel activation. Moreover, they confirm the concept that a cleavage event in γENaC is required as a final step in proteolytic channel activation. The methods described here may well be applicable to address similar questions for other types of ion channels or membrane proteins.
Proteaser er enzymer, der er involveret i forskellige fysiologiske reaktioner, der spænder fra den velkendte proteolytisk nedbrydning af proteiner, i forbindelse med fordøjelsen, til yderst sofistikerede protease kaskader involveret i komplekse regulerende signalveje. Proteaser inddeles i syv grupper efter deres katalytiske aktive site: aspartat, asparagin, cystein, glutaminsyre, metallo, serin og threonin proteaser. Forskellige proteaser målrette forskellige spaltningssteder som ikke altid er let at forudsige fra den primære struktur af et protein. Den Merops database ( http://merops.sanger.ac.uk/ ) indeholder detaljerede oplysninger om en bred vifte af proteaser og deres privilegerede spaltningssites. Funktionelt relevante spaltningssteder kan identificeres under anvendelse af stedorienteret mutagenese.
Det er velkendt, at proteolytisk behandling af ENAC er en vigtig mekanisme for aktivering af ther særlig ionkanal 1,2. Interessant, der er bevis for, at funktionen af den tilhørende syre-sensing ionkanal 1a (ASIC1a) også kan ændres af proteaser 3-5. På nuværende tidspunkt er det stadig et åbent spørgsmål, om proteolytisk kanal spaltning spiller en relevant fysiologisk rolle i reguleringen af aktiviteten af andre ionkanaler eller transportvirksomheder. Det er imidlertid velkendt, at proteolytisk spaltning aktiverer en gruppe af G-protein-koblede receptorer, protease-aktiverede receptorer (Pars) 6. Adskillige serinproteaser (f.eks kanal-aktiverende proteaser (CAP1-3), chymotrypsin, trypsin, furin, plasmin, neutrofil elastase og kallikrein) er blevet vist at proteolytisk aktivere ENAC 2. Ud over serinproteaser, kan andre grupper af proteaser involveret i proteolytisk ENAC aktivering. Faktisk seneste data viser, at den metalloproteinasen meprin-β 7 og cystein protease cathepsin-S 8 kan også activate ENAC. De (pato-) fysiologisk relevante proteaser til ENAC aktivering imidlertid stadig skal bestemmes, og kan variere fra væv til væv.
Proteaser er kendt for fortrinsvis at spalte på bestemte steder i aminosyresekvensen. For eksempel serinprotease chymotrypsin viser en specifik spaltning mønster spaltning efter den aromatiske aminosyre rester phenylalanin og tyrosin. I modsætning hertil serinprotease trypsin efter præference spalter efter den grundlæggende rester lysin eller arginin. Brug mutant menneskelig γENaC konstruktioner genereret ved site-directed mutagenese, kunne funktionelt relevante spaltningssteder i ENAC heterologt udtryk i oocyt ekspressionssystem identificeres 8-13.
Ved at indsprøjte cRNA for de tre ENAC underenheder (αβγ) til isolerede oocytter kan ENAC være funktionelt udtrykt i disse celler og aktiviteten af kanaler til stede på plasmamembranen kan måles vedved hjælp af to elektroder spænding-clamp-teknikken. Ved hjælp af den diuretiske amilorid, en specifik ENAC hæmmer, amilorid-følsomme ENAC-medieret helcelle-aktuelle komponent (Ai ami) kan adskilles fra uspecifikke læk strømme eller strømme, der foretages af andre ionkanaler. Således Ai AMI værdier afspejler generelle ENAC aktivitet og kan bestemmes ved at subtrahere helcelle-strømme målt i nærvær af amilorid fra de tilsvarende helcelle-strømme er optaget i fravær af amilorid. For at teste om en protease har en stimulerende virkning på ENAC, er Ai ami målt to gange i den samme oocyt, dvs før og efter inkubation af oocytten i en protease opløsning. En stigning på Ai ami fra den første til den anden måling indikerer proteolytisk ENAC aktivering. Chymotrypsin eller trypsin vides at maksimalt stimulere ENAC i oocyt-ekspressionssystem 2,14 og kan bruges til at fortrorm at proteolytiske ENAC aktivering kan påvises i en given batch af oocytter.
Parallelt med helcelle-strømmålinger blev en biotinylering tilgang 9 anvendt til at undersøge om stigningen i Ai ami påvist ved udsættelse af oocytterne for proteaser korrelerer med forekomsten af ENAC spaltningsfragmenter på celleoverfladen. Proteiner på celleoverfladen er mærket med biotin og kan adskilles fra intracellulære proteiner ved binding af de biotinylerede proteiner neutravidin-mærkede agaroseperler. De biotinylerede proteiner kan analyseres ved western blot. γENaC spaltningsfragmenter på celleoverfladen kan detekteres ved anvendelse af et specifikt antistof rettet mod en epitop i C-terminalen af γENaC. At identificere funktionelt relevant kløvningssted (r), forudsagde spaltningssites kan muteres ved hjælp af site-directed mutagenese. Vildtype-og mutant kanaler sammenlignes i parallelle eksperimenter under anvendelse af oocytter fra same batch.
Med denne metodik det blev påvist for første gang, at proteolytisk aktivering af ENAC-medierede helcelle-strømme korrelerer med den tidsafhængige udseende ENAC spaltningsfragmenter på celleoverfladen. Disse resultater tyder på en årsagssammenhæng mellem kanal spaltning og kanal aktivering. Desuden, ved hjælp af steddirigeret mutagenese af formodede spaltningssteder i kombination med to-elektrode spænding-clamp-teknikken, funktionelt relevante spaltningssteder for plasmin, chymotrypsin 13 og cathepsin-S-8 blev identificeret.
I dette manuskript en metodisk tilgang som med succes blev anvendt til at studere de mekanismer, der ligger til grund aktivering af ENAC af proteaser er beskrevet 8,13. Den veletablerede Xenopus laevis oocyt udtryk system blev brugt til funktionelt express ENAC. ENAC funktion blev vurderet med det konventionelle to-voltage-clamp-teknikken. Site-directed mutagenese blev anvendt til at identificere funktionelt relevante proteasespaltningssteder. Biotinylering eksperimenter udført parallelt med de elektrofysiologiske målinger gjort det muligt at korrelere forekomsten af ENAC spaltningsprodukter på celleoverfladen med proteolytisk aktuelle aktivering. En sammenhæng mellem tidsforløbet for nuværende aktiveringskode og fremkomsten af proteolytiske spaltningsfragmenter på celleoverfladen støtter ideen proteolytisk kanalaktivering.
To-elektrode spænding-clamp optagelser kræver impalement af en oocyte med to mikroelektroder. Denne procedure udføres sædvanligvis kun én gang i en enkelt oocyt. Det var imidlertid muligt at fjerne mikroelektroder efter en indledende helcelle aktuelle optagelse uden synlig skade på oocyt. Faktisk synes plasmamembranen på de steder, impalements at forsegle inden for et par minutter. Således, efter afslutning af en første to-voltage-clamp-måling, er det muligt at overføre ægget fra den eksperimentelle strømningskammeret af de to elektroder spænding-clamp setup til et mikrocentrifugerør eller en brønd i en 96-brønds plade fyldt med en lille mængde af test eller kontrol løsning. Bagefter kan den samme oocyt overføres tilbage til strømningskammeret og kan spiddet igen for at udføre en anden to-voltage-clamp-måling. Bemærkelsesværdigt havde ENAC medierede ikke varierer meget mellem den første og anden måling, når oocytten blev opretholdt i kontrolopløsning. I modsætning hertil, inkubering af oocytten i en protease indeholdende solution efter den første måling resulterede i øget ENAC-medieret strøm i den anden måling (figur 2). Dette fund tyder på proteolytisk kanalaktivering.
Udførelse af to separate strømmålinger i en enkelt oocyt giver den fordel, at ægget kan blive eksponeret for proteaser eller andre farmakologiske midler mellem de to målinger for en variabel længde af tid i et lille volumen af testopløsning. Dette er vigtigt, når du bruger midler, som er dyre og / eller utilgængelige i store mængder, fx oprensede protease præparater. Den begrænsede tilgængelighed af midler kan gøre det umuligt (eller uoverkommelige) for at bruge dem i kontinuerlige to-elektrode spænding-clamp optagelser på grund af de store mængder af testopløsning kræves for løbende at superfusing oocytter med flowhastigheder på adskillige milliliter per minut. Desuden er kontinuerlige to elektroder spænding-clamp målinger begrænset af den velkendte fænomenEnon for spontan kanal nedtrapning også beskrevet for ENAC 15. Derimod er at udsætte oocytter at teste løsninger mellem to separate målinger i op til en time eller mere generelt ikke et problem (se figur 4A). Endelig to sekventielle målinger udført i samme ægcelle tillade parret observationer af narkotika effekter. Dette har en fordel i forhold uparrede målinger fra to separate grupper af oocytter (protease-behandlede og vehikel-behandlede), fordi det reducerer problemet med høj variabilitet mellem oocyter, sædvanligvis observeret i ionkanal ekspression. Med parrede observationer og muligheden for at normalisere dataene til den første måling er der behov for færre oocytter pr forsøgsgruppe at påvise en signifikant virkning af et farmakologisk middel. Normalisering af data gør det også nemt at opsummere data fra forskellige batches af oocytter med forskellige ionkanal ekspressionsniveauer og dermed forskellige baseline strømme (figur 2D). Naturligvis er det nødvendigt kontrolforsøg for denne fremgangsmåde til at påvise, ionkanalaktiviteten af interesse forbliver stabil i vehikelbehandlede kontrolgruppe oocytter fra den første til den anden måling (se figur 2).
For at påvise at proteolytisk nuværende aktivering korrelerer med forekomsten af ENAC spaltningsprodukter på celleoverfladen, biotinylering fremgangsmåde oprindeligt beskrevet af Harris et al. 9 kan anvendes. Denne procedure (som beskrevet i protokollen afsnit og vist i figur 4) blev tilpasset til at påvise, at eksponeringen af kanaler proteaser og efterfølgende aktivering af ENAC-medierede strømme går hånd i hånd med den tidsafhængige udseende spaltningsfragmenter. Biotinyleringen metode giver også analyse af en samlet stigning eller fald af membranproteiner på celleoverfladen. Således er denne metode egnet til at undersøge effekten af proteaser og andre farmaceutiskehar farmakologisk agenter efter kanal indsætning i plasmamembranen eller efter kanal hentning. Desuden, western blot-analyse af de biotinylerede plasmamembranproteiner muliggør påvisning af proteinfragmenter (f.eks proteolytiske ENAC fragmenter) eller ændringer i glycosyleringsmønster, som kan være funktionelt relevant.
Det konkluderes, at kombinationen af metoder, der anvendes til at undersøge den stimulerende virkning af proteaser på ENAC-medierede helcelle-strømme og til at demonstrere en korrelation med forekomsten af ENAC spaltningsprodukter ved celleoverfladen kan være nyttige for en bred vifte af anvendelser. Især kan disse metoder være egnet til at løse lignende spørgsmål vedrørende regulering af andre ionkanaler, transportører eller transmembrane receptorer (f.eks protease-aktiverede receptorer Pars).
The authors have nothing to disclose.
The expert technical assistance of Céline Grüninger, Christina Lang, Sonja Mayer, and Ralf Rinke is gratefully acknowledged. We thank Dr. Morag K. Mansley for carefully reading the manuscript. This project was supported by a grant of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grant SFB 423: Kidney Injury: Pathogenesis and Regenerative Mechanisms, to C. Korbmacher), grants of the Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (to S. Haerteis and M. Krappitz), the ELAN program (to S. Haerteis) of the Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, and the University Library of Erlangen-Nürnberg.
Bath Clamp Headstage for OC-725C-V | Warner Instrument Corporation | – | |
Cold light source – Schott KL 1500 LCD | Schott | #SCOC150200EU | brightness 4; mechanical aperture: D; color temperature: 3000 K |
E Series Electrode Holder (Str, Vent, Ag Wire, 1.2 mm) | ADinstruments | #ESW-F10v | |
left micromanipulator; MM-33L | Warner Instrument Corporation | #64-0055 | |
LIH 1600 – computer interface | HEKA | – | |
magnetic valve system (ALA BPS-8) in combination with a TIB14 interface (HEKA) | ALA Scientific Instruments, HEKA | – | |
OC-725C amplifier for two-electrode voltage-clamp recordings | Warner Instrument Corporation | – | |
P-97 FLAMING/BROWN Micropipette Puller | Sutter Instruments | – | heat=550; velocity=22; time=200 |
right micromanipulator; MM-33R | Warner Instrument Corporation | #64-0056 | |
Series Electrode Holder (45°, Vent, Handle, Ag Wire, 1.2 mm) | ADinstruments | #E45w-f10vh | |
STAT 2 IV Gravity Flow Controller | Conmed | #P-S2V-60 | |
vacuum generator ejector SEG – for suction to remove bath solution | Schmalz | – | |
Material | |||
INFUJECT 60ml pump syringes for solutions | Braun | #22050 | |
Injekt-F for lysing the oocytes | Braun | #9166033V | |
standard wall borosilicate tubing with filament | Sutter Instruments | #BF150-86-10 | outside diameter: 1.50 mm; inside diameter: 0.86 mm; length: 10 cm |
Reagent | |||
complete, Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Applied Science | #11836170001 | |
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | #21217 | |
Horseradish peroxidase-labeled secondary goat anti-rabbit antibody | Santa Cruz Biotechnology | #sc-2004 | |
NeutrAvidin Agarose | Thermo Scientific | #29200 | Neutravidin-labeled agarose beads |
NP40 (Nonidet P-40) | Sigma-Aldrich | #I8896 | |
Roti-Load 1 (2× SDS-PAGE sample buffer) | Carl Roth | #K929.2 | |
SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate for detection of chemiluminescent signals | Thermo Scientific | #34095 | |
Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 |