Proteolytisk aktivering av epitelial natriumkanal (ENaC), heterologt uttrykt i Xenopus laevis oocytter kan demonstreres ved å kombinere strømmålinger med en biotinylering tilnærming for å undersøke forekomsten av ionekanal spaltningsproduktene på celleoverflaten. Funksjonelt viktige spaltningsseter kan identifiseres ved hjelp av seterettet mutagenese.
The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. In combination with site-directed mutagenesis, this approach provides a powerful tool to identify functionally relevant cleavage sites. Proteolytic activation is a characteristic feature of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel (ENaC). The final activating step involves cleavage of the channel’s γ-subunit in a critical region potentially targeted by several proteases including chymotrypsin and plasmin. To determine the stimulatory effect of these serine proteases on ENaC, the amiloride-sensitive whole-cell current (ΔIami) was measured twice in the same oocyte before and after exposure to the protease using the two-electrode voltage-clamp technique. In parallel to the electrophysiological experiments, a biotinylation approach was used to monitor the appearance of γENaC cleavage fragments at the cell surface. Using the methods described, it was demonstrated that the time course of proteolytic activation of ENaC-mediated whole-cell currents correlates with the appearance of a γENaC cleavage product at the cell surface. These results suggest a causal link between channel cleavage and channel activation. Moreover, they confirm the concept that a cleavage event in γENaC is required as a final step in proteolytic channel activation. The methods described here may well be applicable to address similar questions for other types of ion channels or membrane proteins.
Proteaser er enzymer som er involvert i forskjellige fysiologiske reaksjoner som strekker seg fra den kjente proteolytisk degradering av proteiner i forbindelse med fordøyelsen, til meget avanserte protease kaskader som er involvert i kompliserte reguleringssignalveier. Proteaser er klassifisert i syv grupper etter deres katalytisk aktive området: aspartat, asparagin, cystein, glutaminsyre, metallo, serin og treonin proteaser. Ulike proteaser målrette distinkte spaltningsseter som ikke alltid er lett å forutsi fra den primære strukturen av et protein. Den Merops database ( http://merops.sanger.ac.uk/ ) gir detaljert informasjon om et bredt spekter av proteaser og deres fortrinnsrett spaltningsseter. Funksjonelt relevante spaltningsseter kan identifiseres ved hjelp av seterettet mutagenese.
Det er vel etablert at proteolytisk prosessering av ENaC er en viktig mekanisme for aktivering av ther bestemt ionekanal 1,2. Interessant er det bevis for at funksjonen til den relaterte syre-sensing ionekanal 1a (ASIC1a) kan også endres av proteaser 3-5. I dag er det fortsatt et åpent spørsmål om proteolytisk kanal cleavage spiller en relevant fysiologisk rolle i å regulere aktiviteten til andre ionekanaler eller transportører. Imidlertid er det vel etablert at proteolytisk spaltning aktiverer en gruppe av G protein-koblede reseptorer, protease-aktiverte reseptorer (PARS) 6. Flere av serinproteaser (f.eks kanal-aktiverende proteaser (CAP1-3), chymotrypsin, trypsin, Furin, plasmin, neutrofil elastase, og kallikrein) har blitt vist å aktivere proteolytisk ENaC 2. I tillegg til serin-proteaser, kan andre grupper av proteaser involvert i proteolytisk ENaC aktivering. Faktisk viser nyere data at metalloproteinase meprin-β 7 og cystein protease cathepsin-S 8 kan også activate ENaC. Men de (patho-) fysiologisk relevante proteaser for ENaC aktivisering fortsatt å være bestemt og kan variere fra vev til vev.
Proteaser er kjent for å fortrinnsvis holde seg på bestemte steder i aminosyresekvensen. For eksempel, viser serinprotease chymotrypsin en spesifikk spalting mønster spalte etter at den aromatiske amino-syre-rester fenylalanin og tyrosin. I kontrast, serin protease trypsin preferensielt spalter etter den grunnleggende rester lysin eller arginin. Ved hjelp av mutant menneskelige γENaC konstruerer generert av seterettet mutagenese, kunne funksjonelt relevante spaltningsseter i ENaC heterologt uttrykt i eggcelle uttrykk system identifiseres 8-13.
Ved å injisere cRNA for de tre ENaC-subenheter (αβγ) i isolerte oocytter kan ENaC være funksjonelt uttrykt i disse celler, og aktiviteten av kanaler til stede på plasmamembranen kan måles ved hjelpved hjelp av to-elektrodespenningsklemme teknikk. Ved å bruke den diuretiske amilorid, en spesifikk ENaC inhibitor, den amilorid-sensitive ENaC-mediert hel-cellestrømmen komponent (ΔI ami) kan separeres fra uspesifikke lekkasjestrømmer eller strømmer utført av andre ionekanaler. Således ΔI ami verdier reflekterer generelle ENaC-aktivitet, og kan bestemmes ved å trekke av hele celle-strømmer målt i nærvær av amilorid fra de tilsvarende hel-celle-strømmer som er tatt opp i fravær av amilorid. For å teste om en protease har en stimulerende effekt på ENaC er ΔI ami målt to ganger i samme eggcelle, dvs. før og etter inkubering av oocytten i en protease inneholdende løsning. En økning av ΔI ami fra den første til den andre målingen indikerer proteolytisk ENaC aktivering. Chymotrypsin eller trypsin er kjent for å stimulere maksimalt ENaC i oocytt ekspresjonssystem 2,14, og kan brukes til å konfirm at proteolytisk ENaC aktivering er synlig i en gitt batch av ubefruktede egg.
Parallelt med hel-celle-strømmålinger ble en biotinylering tilnærming 9 brukes til å undersøke om økningen i ΔI ami detekteres ved eksponering av oocyttene til proteaser korrelerer med fremkomsten av ENaC spaltningsenzymer fragmenter på celleoverflaten. Proteiner på celleoverflaten, er merket med biotin, og kan separeres fra intracellulære proteiner ved å binde det biotinylerte protein til NeutrAvidin merkede agarosekuler. De biotinylerte proteiner kan bli analysert ved western blot. γENaC cleavage fragmenter på celleoverflaten kan detekteres ved hjelp av et spesifikt antistoff rettet mot en epitop i C-terminus av γENaC. Å identifisere funksjonelt relevant cleavage (r), spådde spaltningsseter kan mutert bruker nettstedet rettet mutagenese. Villtype-og mutant-kanaler blir sammenlignet i parallelle eksperimenter med oocytter fra same batch.
Med denne Metodikken ble det påvist for første gang at proteolytisk aktivering av ENaC-medierte hel-celle strømmer korrelerer med den tidsavhengige opptreden av ENaC spaltningsenzymer fragmenter på celleoverflaten. Disse resultatene tyder på en årsakssammenheng mellom kanal cleavage og kanal aktivering. Videre ble ved bruk av seterettet mutagenese av antatte spaltningsseter i kombinasjon med de to-elektrodespenningsklemme teknikk, funksjonelt relevante spaltningsseter for plasmin, chymotrypsin 13 og katepsin-S 8 identifisert.
I dette manuskriptet en metodisk tilnærming som ble vellykket anvendt for å studere mekanismene bak aktiveringen av ENaC av proteaser er beskrevet 8,13. Den godt etablerte Xenopus laevis eggcelle uttrykk systemet ble brukt til funksjonelt express ENaC. ENaC funksjon ble vurdert med vanlig to-elektrode spennings klemme teknikk. Seterettet mutagenese ble ansatt for å identifisere funksjonelt relevante protease spaltningsseter. Biotinylering eksperimenter utført i parallell med den elektrofysiologiske målinger gjort det mulig å korrelere fremkomsten av ENaC spaltningsproduktene på celleoverflaten med proteolytisk strømaktivering. En korrelasjon mellom tidsforløpet av strømaktivering, og fremkomsten av proteolytisk spaltning fragmenter på celleoverflaten støtter konseptet med kanalaktivering proteolytisk.
To-elektrode voltage-clamp opptak krever impalement av en oocyte med to mikroelektroder. Denne prosedyren utføres vanligvis bare en gang i et individuelt eggcelle. Imidlertid var det mulig å fjerne de mikroelektroder etter en innledende hel-celle aktuelle opptaket tilsynelatende uten skade på oocyte. Faktisk plasmamembranen på de steder av impalements synes å forsegle i løpet av få minutter. Således, etter å ha fullført et første to-elektrodespenningsklemme måling, er det mulig å overføre en oocytt fra den eksperimentelle strømningskammeret i to-elektrodespenningsklemme oppsett i et mikrosentrifugerør eller en brønn av en 96-brønns plate som er fylt med et lite volum av test-eller kontrolloppløsningen. Deretter kan den samme eggcelle bli overført tilbake til strømningskammeret, og kan være spiddet på nytt for å utføre en andre to-elektrodespenningsklemme måling. Bemerkelsesverdig ble ENaC-mediert strøm, ikke varierer mye mellom den første og andre målingen når oocytten ble opprettholdt i kontrolloppløsningen. I motsetning til dette inkubasjon av oocytten i en protease inneholdende solution etter den første måling resulterte i økt ENaC-mediert strøm i den andre målingen (fig. 2). Dette funnet indikerer kanal aktivering proteolytisk.
Utføre to separate strømmålinger i et enkelt oocytten har den fordelen at en oocytt kan bli utsatt for proteaser eller andre farmakologiske midler mellom de to målinger for et variabelt tidsrom i et lite volum av testoppløsningen. Dette er viktig ved bruk av midler som er kostbare og / eller ikke tilgjengelig i store mengder, f.eks rensede protease-preparater. Den begrensede tilgjengeligheten av agenter kan gjøre det umulig (eller uoverkommelig) å bruke dem i kontinuerlig to-elektrode voltage-clamp opptak på grunn av de store volumene av testløsning som kreves for kontinuerlig superfusing ubefruktede egg med hastighetsmåling av flere milliliter per minutt. Videre er kontinuerlig to-elektrode voltage-clamp målinger begrenset av den velkjente fenomenetEnon av spontan kanal trekk også beskrevet for ENaC 15. I kontrast, utsette oocytter for å teste løsninger mellom to separate målinger for opptil en time eller mer ikke generelt utgjøre et problem (se figur 4A). Til slutt, to påfølgende målinger utført i samme eggcelle tillate sammenkoblede observasjoner av narkotika effekter. Dette har en fordel i forhold til uparede målinger fra to separate grupper av oocytter (protease-behandlede og bærer-behandlet), fordi det reduserer problemet med høy variabilitet mellom oocytter, vanligvis observert i ionekanal ekspresjon. Med sammenkoblede observasjoner og muligheten for å normalisere dataene til den første måling, er færre oocytter som trengs pr forsøksgruppe for å vise en signifikant effekt av et farmakologisk middel. Normalisering av data gjør det også enkelt å oppsummere data fra ulike grupper av ubefruktede egg med ulike ionekanal uttrykk nivåer og dermed ulike utgangsstrømmer (Figur 2D). Selvfølgelig kontrolleksperimenter som er nødvendige for denne fremgangsmåten for å vise at ionekanal aktiviteten av interesse forblir stabil i bærer-behandlede kontroll-oocytter fra den første til den andre målingen (se figur 2).
For å demonstrere at proteolytisk strømaktivering korrelerer med utseendet av ENaC spaltningsproduktene på celleoverflaten, en biotinylering metode som opprinnelig er beskrevet av Harris et al. Ni kan brukes. Denne fremgangsmåten (som beskrevet i protokollen delen og er vist i figur 4) er innrettet til å vise at eksponering av kanaler til proteaser og etterfølgende aktivering av ENaC-mediert strøm, er parallell med den tidsavhengige opptreden av spaltningsseter fragmenter. Den biotinylering fremgangsmåte gjør det også mulig å analysere en økning eller reduksjon av membranproteiner på celleoverflaten. Således er denne fremgangsmåte er egnet for å undersøke effekten av proteaser og andre akterisertfarmakologiske midler ved kanal innsetting inn i plasmamembranen, eller ved kanalinnhenting. Videre tillater western blot analyse av de biotinylerte plasmamembranproteiner påvisning av proteinfragmenter (f.eks proteolytiske ENaC-fragmenter) eller endringer i glykosyleringsmønster som kan være funksjonelt relevant.
Konklusjonen er at den kombinasjon av metoder som brukes for å undersøke den stimulerende effekt av proteaser på ENaC-medierte hel-celle-strømmer, og for å påvise en sammenheng med forekomsten av ENaC spaltningsproduktene på celleoverflaten, kan være nyttig for et bredt spekter av anvendelser. Særlig kan disse fremgangsmåter være egnet for å løse liknende art til regulering av andre ionekanaler, transportører eller transmembrane reseptorer (for eksempel protease-aktiverte reseptorer PARS).
The authors have nothing to disclose.
The expert technical assistance of Céline Grüninger, Christina Lang, Sonja Mayer, and Ralf Rinke is gratefully acknowledged. We thank Dr. Morag K. Mansley for carefully reading the manuscript. This project was supported by a grant of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grant SFB 423: Kidney Injury: Pathogenesis and Regenerative Mechanisms, to C. Korbmacher), grants of the Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (to S. Haerteis and M. Krappitz), the ELAN program (to S. Haerteis) of the Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, and the University Library of Erlangen-Nürnberg.
Bath Clamp Headstage for OC-725C-V | Warner Instrument Corporation | – | |
Cold light source – Schott KL 1500 LCD | Schott | #SCOC150200EU | brightness 4; mechanical aperture: D; color temperature: 3000 K |
E Series Electrode Holder (Str, Vent, Ag Wire, 1.2 mm) | ADinstruments | #ESW-F10v | |
left micromanipulator; MM-33L | Warner Instrument Corporation | #64-0055 | |
LIH 1600 – computer interface | HEKA | – | |
magnetic valve system (ALA BPS-8) in combination with a TIB14 interface (HEKA) | ALA Scientific Instruments, HEKA | – | |
OC-725C amplifier for two-electrode voltage-clamp recordings | Warner Instrument Corporation | – | |
P-97 FLAMING/BROWN Micropipette Puller | Sutter Instruments | – | heat=550; velocity=22; time=200 |
right micromanipulator; MM-33R | Warner Instrument Corporation | #64-0056 | |
Series Electrode Holder (45°, Vent, Handle, Ag Wire, 1.2 mm) | ADinstruments | #E45w-f10vh | |
STAT 2 IV Gravity Flow Controller | Conmed | #P-S2V-60 | |
vacuum generator ejector SEG – for suction to remove bath solution | Schmalz | – | |
Material | |||
INFUJECT 60ml pump syringes for solutions | Braun | #22050 | |
Injekt-F for lysing the oocytes | Braun | #9166033V | |
standard wall borosilicate tubing with filament | Sutter Instruments | #BF150-86-10 | outside diameter: 1.50 mm; inside diameter: 0.86 mm; length: 10 cm |
Reagent | |||
complete, Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Applied Science | #11836170001 | |
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | #21217 | |
Horseradish peroxidase-labeled secondary goat anti-rabbit antibody | Santa Cruz Biotechnology | #sc-2004 | |
NeutrAvidin Agarose | Thermo Scientific | #29200 | Neutravidin-labeled agarose beads |
NP40 (Nonidet P-40) | Sigma-Aldrich | #I8896 | |
Roti-Load 1 (2× SDS-PAGE sample buffer) | Carl Roth | #K929.2 | |
SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate for detection of chemiluminescent signals | Thermo Scientific | #34095 | |
Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 |