The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.
Skeletmuskel er en unik væv på grund af dens struktur og funktion, som kræver særlige protokoller til væv samling for at opnå optimale resultater fra funktionelle, cellulære, molekylære og patologisk evalueringer. På grund af den subtile nogle patologiske abnormiteter set i medfødte muskelsygdomme og potentialet for fiksering til at blande sig med anerkendelsen af disse funktioner, patologisk vurdering af frosne muskler er at foretrække frem for faste muskler, når de evaluerer skeletmuskulatur for medfødt muskelsygdom. Derudover potentialet til at producere alvorlige fryse artefakter i musklen kræver særlige forholdsregler, når frysning skeletmuskulatur til histologisk undersøgelse, der ikke er almindeligt anvendt, når frysning andre væv. Dette håndskrift beskriver en protokol for hurtig nedfrysning af skeletmuskulaturen ved hjælp isopentan (2-methylbutan) køles med flydende nitrogen for at bevare optimal skeletmuskulatur morfologi. Denne procedure er også effektiv til freezing væv beregnet til genetiske eller protein ekspressionsundersøgelser. Desuden har vi integreret vores nedfrysning i en bredere procedure, der også beskriver foretrukne fremgangsmåder til på kort sigt triage væv for (1) enkelt fiber funktionelle undersøgelser og (2) myoblast cellekultur med fokus på minimal indsats nødvendigt at indsamle væv og transportere det til specialiserede forsknings-eller reference-laboratorier til at gennemføre disse undersøgelser. Samlet set dette manuskript giver en oversigt over, hvordan frisk væv effektivt kan distribueres til en række fænotypiske studier og giver dermed standardprocedurer (SOP) for patologiske undersøgelser i forbindelse med medfødt muskelsygdom.
Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which can present a number of challenges when evaluating its pathology. While it is sufficient, and often even optimal, to evaluate most tissues following formalin fixation and paraffin embedding, this process leads to the production of cell shrinkage artifacts that impair the evaluation of critical phenotypes in congenital muscle disease (including myofiber size and shape). Additionally, frozen muscle is required when performing many histochemical stains (including the reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), cytochrome oxidase (COX), succinate dehyrogenase (SDH), adenosine triphosphatase (ATPase), and Oil Red O stains) that are essential for the detection of specific pathological abnormalities required to diagnose a variety of congenital myopathies, mitochondrial myopathies, and storage diseases. Many antibodies and molecular tools used to characterize muscle morphology and function have consequently been developed and optimized only for frozen tissue, which further limits the usefulness of fixed tissue preparations in studies of skeletal muscle biology. As a result, it has become standard practice to freeze skeletal muscle specimens for most clinical and research indications in the field of congenital muscle disease, despite the technical challenges that appropriate freezing might pose.
The freezing of skeletal muscle can be technically challenging due to the high likelihood of ice crystal formation within myofibers when an inappropriate freezing protocol is followed1. In most cases, freezing artifacts are encountered when the water content of the tissue is too high or when the freezing process is too slow. The water content of tissue can be accidentally increased by immersion in fluid, such as transport of the muscle in saline; or freezing can be compromised if the tissue has been entirely immersed in OCT. Both of these procedures can lead to catastrophic freezing artifacts in muscle tissue. Additionally, a number of small missteps in the freezing process may cause slow freezing or accidental thawing of samples after appropriate freezing, and these issues can similarly complicate pathological evaluation.
As new models and treatments for skeletal muscle disease are developed, it will become increasingly useful to use standard operating procedures (SOPs) to evaluate skeletal muscle phenotypes and treatment efficacy. This is particularly important for the pathological evaluation of congenital muscle diseases, as the recognition of subtle phenotypes seen in many of these disorders can be impaired by improper tissue preparation. This report represents an effort by a Congenital Muscle Disease Consortium to establish a skeletal muscle freezing SOP for the study of congenital muscle disease models.
The protocol presented here describes a strategy used in our clinical and research labs to optimize assessment of frozen muscle pathology, while also being suitable for a variety of protein-based and genetic studies. Specific strategies to prepare skeletal muscle specimens for electron microscopy are also presented. Additionally, as single fiber functional testing of frozen tissue is possible2,3, experts in these techniques have provided details on optimal tissue handling protocols. Unfortunately, the isolation of myoblast cell lines cannot be effectively performed on pre-frozen tissue, so a strategy is presented herein for the short-term storage and transport of muscle tissue for myoblast culture establishment at outside laboratories. Overall, the methods described here provide guidelines for the appropriate processing of muscle tissue for a variety of pathological, functional, molecular and cellular studies, regardless of the on-site capabilities of a given laboratory.
Skeletmuskel er et strukturelt og funktionelt enestående væv, og specialiserede forberedelse procedurer er nødvendige for at give den optimale vurdering af strukturelle og funktionelle parametre. Mens en række forskellige væv almindeligvis er frosset til patologiske undersøgelser i kliniske og forskningsmæssige sammenhænge, indefrysning protokoller for ikke-muskelvæv normalt indebærer total fordybelse af vævet i OCT inden frysning. Som vist i figur 3, en sådan protokol er uegnet til patologisk evaluering af skeletmuskulatur og alligevel er tilstrækkeligt ens til protokollen beskrevet her, at dette er en almindeligt forekommende fejl. Målet med dette oplæg er at give en enkel protokol for korrekt håndtering af muskel for at undgå spørgsmål som dette. Rådgivning er også blevet udarbejdet på korrekt håndtering af muskel for off-site fysiologiske og cellulære studier i et forsøg på at lette erhvervelsen af data af høj kvalitet af eksterne centrale laboratorier, where undersøgelser på stedet ikke er at foretrække eller mulig.
Som nævnt i denne protokol, elementer, der er helt afgørende i den korrekte behandling af muskel til patologiske undersøgelser omfatter minimere indholdet af vævet vand, faldende temperatur, hvor musklen er frosset, og øger den hastighed, hvormed frysning er opnået. Overdreven fugt i vævet eller overdreven langsommelighed fryseprocessen (produceret af utilstrækkelige temperaturer eller ved manglende direkte kontakt mellem frysning agent og væv, som er stødt på med flydende kvælstof), vil føre til indefrysning artefakter, der kan forringe patologisk analyse. Som oktober giver en ekstra kilde til væv fugt, mange laboratorier bruge andre klæbestoffer som tragacanthgummi som en indlejring substrat. Selv i tilfælde, hvor frost udføres korrekt, bør der udvises forsigtighed for at undgå efterfølgende uheld optøning prøver gennem kontakt med RT beholdere eller instrumenter.En vellykket frysning kræver en grad af planlægning, der omfatter en forud afkøling af alle instrumenter og beholdere, der skal anvendes. Ved indfrysning af artefakter er stødt på, er der en metode, der er beskrevet her til genopretning af det væv, der er tilstrækkelig for de fleste patologiske evalueringer. Men denne fryse / tø cyklus ikke tilbyde perfekt histologi og har potentiale til at forringe andre molekylære eller enzymatiske undersøgelser af væv (ud over den tid, der kræves til at re-fryse vævet), så ved hjælp af passende indledende indefrysning praksis er langt at foretrække . I tilfælde, hvor frysning artefakt stødt på præ-frosset væv, dog kan den teknik, der er beskrevet heri, kan være særdeles nyttig.
Fiksering og forarbejdning af væv til EM kan tilbyde specifikke tekniske udfordringer, der kræver planlægning forud for væv samling. Den mest almindelige fejl, når indsamling af prøver til EM indebærer brug af vævsfragmenter, der er for tyk til glutaraldehyde til at trænge igennem. Som glutaraldehyd kun trænger ca 0,1 cm i muskelvæv fra en given overflade, pleje bør tages for at sikre, at én dimension af EM-prøverne ikke er tykkere end 0,2 cm. Derudover, da EM er et glimrende middel til direkte at vurdere kontraktile apparat, har nogle forskere udviklet strategier til at pre-spænding eller pre-stretch musklen før fiksering for at tillade måling af kontraktile elementer på en fysiologisk relevant spænding. Der er ingen standard-protokol til forspænding, men to strategier er kort beskrevet i denne protokol. Det skal bemærkes, at forsøg på at forspænding musklen kan producere uforudsigelige resultater, medmindre de er gjort på en meget konkret måde, og det kan være at foretrække at fastsætte muskler i slap tilstand for at forhindre kunstig ændringer i sarkomer længde gennem en ikke-standard forspænding procedure 8,9. For muskler hvor sådanne konkrete målinger ikke er nødvendige (herunder de fleste biopsies udføres til kliniske formål), er generelt ikke gjort en indsats for at forspænding musklen, og den primære effekt på muskel morfologi er en uensartet afstand af sarcomeres i musklen.
Dette papir er den første i en serie for at give SOP for udførelsen af test i medfødt muskelsygdom felt, og det repræsenterer de bestræbelser over 20 eksperter i medfødt område muskel sygdom, der rutinemæssigt udføre cellulære, molekylære, funktionelle, fysiologiske og patologisk forskning. En række offentliggjorte SOP'er vil blive stillet til rådighed i det kommende år, og de nødvendige protokoller og passende offentliggørelse formater til hver blev drøftet på en medfødt muskelsygdom Consortium Workshop afholdt i april 2013 i Washington DC Målet med denne SOP indsats er at give en køreplan for den nødvendige afprøvning og analyse af prøver i det medfødt område muskelsygdom 1) at standardisere praksis og endpoints, der anvendes i vores område som mUCH som muligt, og 2) give instruktion om standard praksis for nye forskere inden for vores felt. Vi mener, at disse midler vil gøre det lettere for nye efterforskere i vores under-studerede felt og dermed forbedre omfanget af forskning, der kan udføres. Derudover vil en standardisering af praksis være yderst nyttigt at sammenligne data på tværs af studier og identificere endpoints når planlægning og udførelse af prækliniske og kliniske forsøg.
Mens det vigtigste fokus i denne artikel er relateret til den passende frysning og forberedelse af væv til en række undersøgelser, vores kollaborative gruppe drøftede også de nyttige endpoints for patologisk analyse af muskel prøver. På nuværende tidspunkt er der ingen officiel enighed om tilgang til at tage, når du udfører patologisk analyse, og en række forskellige undersøgelser er udført for at relatere nye resultater til tidligere publikationer for de enkelte sygdomme. Således har vi troet, at det ville være nyttigt atforeslå nogle generelle retningslinjer for planlægning af patologiske endepunkter i muskel patologi karakterisering. Forud for kvantificering af patologi i en undersøgelse, bør store tanke sættes i 1) målemetoden fiber størrelse, 2) muligheden for fiber-typespecifikke abnormiteter eller behandling virkninger, 3) muligheden for abnormiteter eller effekter, der er begrænset individuelle muskler, og 4) en strategi til kvantificering patologiske fund, der er karakteristisk for sygdommen under undersøgelsen. Fiber størrelse er en nødvendig endpoint for de fleste undersøgelser, og desværre er der en omfattende variation i, hvordan det er kvantificeret. Mange undersøgelser rapporterer disse resultater ved hjælp af automatiserede kvantificering fra proprietære imaging software, men mange af disse programmer tager genveje (såsom at antage, at fibrene er cirkler eller ellipser), der kan gøre disse automatiserede målinger unøjagtige. Det er nødvendigt at forstå, hvordan disse automatiske programmer gøre deres målinger bør have tillid til målingerne, og vi opfordrer efterforskere til at medtage disse oplysninger i papir metoder. Derudover specifik måling anvendes til at betegne fiberstørrelse er yderst variabel og visse målinger er at foretrække frem for andre 10,11. Et almindeligt anvendt måling af fiber størrelse er fiberen tværsnitsareal (CSA), især fordi efterforskerne udfører fysiologiske studier standardisere deres resultater til CSA målinger opnået ved hjælp af deres instrumenter. Desværre, mens CSA målinger præcist kan afspejle fiber størrelse i perfekt tværsnit, er de i vid udstrækning afhængige af fiber orientering (i det omfang, langsgående eller skråt-delt fibre vil have kunstigt høje CSA målinger), og er således ikke ideelle målinger for fiber størrelse. Et foretrukket måling af fiber størrelse, der er mindre afhængig af fiber tværsnitsareal er minimum Feret diameter (MinFeret diameter), som er målingen af the mindre diameter i musklen celle 12. Denne måling er kun lidt afhængig af fiberorientering og er generelt klinisk guldstandard til måling fibre og undersøgere opfordres til at bevæge sig mod anvendelse af denne teknik. Disse målinger kan ofte ske ved hjælp af den samme software, der genererer CSA målinger 13, og er også ligetil at måle manuelt. Med hensyn til vurderingen af de patologiske data i henhold til fibertype, specifik muskel, og i forbindelse med patologiske fund relateret til den specifikke sygdom, disse er mindre kontroversielle emner, der bare skal overvejes under planlægningen af en undersøgelse. Fiber type kan evalueres ved hjælp af immunhistokemisk eller ATPase farvning, men det er nyttigt at overveje at specifikke muskler og dyrearter har særlige blandinger af disse fibertyper (hvilket nødvendiggør forskellige forventninger og testningsstrategier). Muskel specifik patologisk involvering eller behandlingseffektkan forekomme, og den samlede muskel vægt i forhold til kontroller kan bruges til at identificere graden af heterogenitet af sygdom, før der træffes beslutning om musklerne til at patologisk evaluere. Endelig er det velkendt, at mange muskelsygdomme er associeret med specifikke patologiske abnormiteter (såsom nemaline stænger i nemaline myopati) 14,15, og så er det også nyttigt at overveje, om disse abnormiteter er fundet i en fiber-type eller muskel -specifik fordeling, når du udfører analysen 16,17. Samlet set mens vi ikke foreslå en ufleksibel sæt standarder for evaluering af muskler, tror vi, at disse spørgsmål bør overvejes forud for udførelsen af patologiske undersøgelser i enhver skeletmuskulatur sygdom.
The authors have nothing to disclose.
This publication is funded through Cure CMD, an Association Contre Les Myopathies (AFM) grant (project 16297), and the National Institutes of Health (grant numbers K08 AR059750 and L40 AR057721). We would also like to thank Dr. Julie Tetzlaff for her assistance in revising this manuscript.
For tissue freezing | |||
Liquid nitrogen Dewar with a liquid withdrawal device | Custom Biogenic Systems | Lab-5 Series | Any other liquid nitrogen dewar could substitute. |
Cold-conductive container | Fisher | 02-583A | |
Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen | Nalgene | 4150-2000 | |
Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer | Thomas Scientific | 1228Y01 | Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing. |
For single fiber functional testing | |||
Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11 | |
Sylgard coating | Ellsworth Adhesives | 3-6636 | |
Dissection stereomicroscope | Harvard Apparatus | 693101 | Any other dissection microscope could substitute. |
For cell culture | |||
Sterile laminar flow hood | Thermo Scientific | 51022485 | Any other cell culture hood could substitute. |
Materials | |||
For tissue freezing | |||
Plastic bags/containers | Nasco | B01009WA | |
Thermal safety gloves | Denville | G4162 | |
Face shield | Fisher Scientific | S47640 | |
Long forceps | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
Marker | Staples | 125328 | |
For cell culture | |||
Sterile 50 mL conical tubes | Denville | C1060-P | |
PES filter unit, 500 mL, 0.22 µm | Denville | F5227 | |
Sterile forceps | Fisher Scientific | 644320 | |
Ice packs | Fisher Scientific | NC9909223 | |
Insulated Styrofoam box | Polar Tech | 207F | |
Packing tape | Staples | 795570 | |
Reagents | |||
Tissue Freezing | |||
Liquid nitrogen | Airgas | NI NF160LT350 | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
Isopentane (2-methylbutane) | Sigma | M32631-4L | Store Isopentane in a flammable materials cabinet. |
EM fixative (choose one) | The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM. | ||
2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 16537-15 | |
Karnovsky's fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer) | Electron Microscopy Sciences | 15732-10 | |
For functional studies (if desired) | |||
Relaxing solution, containing (in mmol/L) | |||
40 BES | Sigma | B9879 | |
10 EGTA | Sigma | E4378 | |
6.56 MgCl2 | Sigma | M8266 | |
5.88 Na-ATP | Sigma | A3377 | |
1.0 DTT | RPI | D11000 | |
46.35 K-propionate | Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1 | ||
15 creatine phosphate, pH 7.0 | Sigma | P7936 | |
0.4 leupeptin | Calbiochem | 10895 | |
0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
Skinning solution, containing | |||
Relaxing solution (See Above) | |||
0.5% Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Indicating silica granules | |||
Flat pieces of cork (1 x 1 inch) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
Glycerol | Sigma | G2025 | |
For cell culture (if desired) | |||
Complete Growth Medium, containing (for 500 mL) | Sterilize by filtering the solution through a 500 mL 0.22 µm PES filter unit. Store at 4°C and use within 1 month. | ||
395 mL of high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D5671 | |
100 mL of fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F6178 | |
5 mL of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) | Sigma | G1146 | |
Storage requriements | |||
See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications |