MicroRNA Expression Profiler af menneskelige iPS celler, retinale pigmentepitel arvet fra iPS og Føtal retinale pigmentepitel
Summary
MicroRNA (miRNA) profiler af human induceret pluripotente stamceller (iPS-celler), retinal pigment epitel (RPE) fra humant induceret pluripotente stamceller (iPS) celler (iPS-RPE), og føtal RPE, blev sammenlignet.
Abstract
Formålet med denne rapport er at beskrive de protokoller til sammenligning af microRNA (miRNA) profiler af human induceret pluripotente stamceller (iPS-celler), retinal pigment epitel (RPE) afledt af humane iPS celler (iPS-RPE), og føtal RPE. Protokollerne omfatter indsamling af RNA til analyse ved microarray og analyse af microarray data til at identificere miRNA, der udtrykkes forskelligt blandt tre celletyper. Metoderne til dyrkning af iPS celler og føtale RPE er forklaret. Den protokol, der anvendes til differentiering af RPE fra human iPS er også beskrevet. RNA-ekstraktion teknik beskriver vi blev udvalgt til at tillade maksimal genvinding af meget små RNA til anvendelse i en miRNA microarray. Endelig cellulære vej og netværk analyse af microarray data forklaret. Disse teknikker vil lette sammenligningen af de miRNA profiler af tre forskellige celletyper.
Introduction
Stamceller har evnen til at replikere uden begrænsning og potentialet til at differentiere til enhver somatiske celletype. Udviklingen af teknikker til at omprogrammere somatiske celler i pluripotente stamceller har fremkaldt stor begejstring i forskerkredse og blandt klinikere, som fremkomsten af personlige vævsregenerering er på horisonten 1.. Induceret pluripotente stamceller (iPS-celler) udviser de samme funktioner i ubegrænset replikation potentiale og pluripotency som embryonale stamceller (ES) celler, mens omgå de etiske dilemmaer, der er forbundet med økonomiske og sociale råd. Desuden vil patientens stamceller ikke stimulerer et immunrespons, hvilket øger sandsynligheden for vellykket terapeutiske anvendelser 2-3. Under bestemte dyrkningsbetingelser har iPS celler blevet vist at differentiere til flere forskellige celletyper in vitro, herunder cardiomyocytter, neuroner, pancreas-beta-celler, hepatocytter og retinal pigment epithelium (RPE) 4-12.
RPE er en specialiseret lag af pigmenterede epitelceller placeret på bagsiden af nethinden, der udfører en række funktioner, der er afgørende for visuel sundhed og funktion, såsom absorption af falsk lys, fagocytose af fotoreceptor ydre segmenter, og behandling af retinoider til fremstilling af visuel chromophor. Dysfunktion af RPE grund af skader eller sygdom påvirker dybt fotoreceptor sundhed og visuel funktion som det fremgår af blindende sygdomme, som er resultatet af underliggende RPE patologi, såsom aldersrelateret makulær degeneration (AMD), Stargardts sygdom og retinitis pigmentosa (RP) 13.. Virkelig effektive behandlinger, der kan genoprette vision ikke er blevet nået, og udskiftning af syge RPE med sund RPE kan være den bedste mulighed for at forhindre tab af synet 14-15. RPE afledt iPS (iPS-RPE) er en mulig kilde til celler til at erstatte den beskadigede RPE. iPS-RPE udtrykker kendetegntic RPE proteiner LRAT, CRALBP, PEDF og RPE65; viser den klassiske stærkt pigmenteret sekskantede RPE morfologi; og udfører RPE funktioner såsom fagocytose, retinoid behandling, og sekretion af 11 – cis retinal 5,16. Men før iPS-RPE kan bruges terapeutisk, IPS-RPE skal være grundigt karakteriseret. Forståelse af de faktorer, der styrer RPE differentiering er nødvendig for at forbedre udbyttet og renheden af de celler, der skal anvendes til kliniske anvendelser.
Celledifferentiering er resultatet af stærkt reguleret genekspression. Epigenetisk ombygning af genomet og koordinering af transkriptionsfaktorer er nødvendige for celle skæbne beslutninger, der opstår under differentiering og udvikling 17.. Regulering af besked RNA (mRNA) oversættelse af microRNA (miRNA) præsenterer endnu et niveau af regulering, der påvirker celle skæbne 1. MiRNA er korte, ~ 22 nt, længder af nukleotider, der enten undertrykke oversættelsebinding til 3'UTR af mRNA eller målrette mRNA for nedbrydning. MiRNA er blevet påvist i næsten alle væv og til dato har over 2.000 unikke menneskelige microRNA er blevet registreret i miRBase databasen. Da miRNA kræver kun delvis komplementaritet til at binde til target mRNA, kan en enkelt miRNA potentielt binder til ti eller hundrede mål, og vice versa, dvs en enkelt mRNA kan målrettes ved flere forskellige miRNA. Denne promiskuøs binding egenskab dramatisk øger niveauet af kompleksitet regulering samt sværhedsgraden bestemme funktionerne enkelte miRNA og den rolle hver spiller i cellulære funktioner 18-21. Ikke desto mindre har undersøgelser vist, at miRNA raffinerer genekspression under differentiering ved at påvirke DNA methylering status 17. I en undersøgelse mere specifik RPE blev miR-204/211 vist sig at fremme epitel fænotype af RPE 22. En anden gruppe analyserede miRNA profilenaf RPE under differentiering fra ES-celler og afslørede forskellige sæt miRNA udtrykkes under differentieringsprocessen 23. Faktisk kan miRNA profiler utvetydigt at skelne celletyper, herunder ES-celler, precursorceller og terminalt differentierede celler 24,25. Over 250 miRNA er udtrykt i nethinden. Baseret på disse studier, vi hypotesen, at miRNA spiller en vigtig rolle under differentieringen af RPE fra iPS.
Formålet med denne rapport er at beskrive de protokoller for differentiering af RPE fra IMR90-4 iPS celler, samling af RNA til analyse ved microarray og analyse af microarray data til at identificere miRNA, der udtrykkes forskelligt blandt tre celletyper, iPS celler IPS-RPE og føtal RPE. Totalt RNA blev ekstraheret fra kulturer af hver celletype og hybridiseret til en miRNA microarray indeholdende prober specifikke for 1.205 miRNAer og 144 virale miRNA. Microarray resultater blev sammenlignd for at bestemme, hvilke miRNA blev differentielt udtrykt blandt de forskellige celletyper. miRNA med 2 gange eller mere fold ændring i ekspressionen blev udvalgt til yderligere analyse. En miRNA analyse software program der blev brugt til at identificere potentielle mål for de differentielt udtrykte miRNA og skabe mobilnetværk reguleret af de udvalgte miRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Afslutningsvis denne rapport beskriver de metoder, der anvendes til kultur iPS celler, iPS-RPE og føtal RPE. RPE stammer fra iPS er morfologisk og funktionelt ligner føtal RPE. IPS-RPE udtrykker også karakteristiske RPE gener, herunder RPE65, CRALBP, PEDF og LRAT 16.. For yderligere at karakterisere disse celler blev RNA ekstraheret og anvendt til at udføre microarray analyse for at identificere differentielt udtrykte miRNA. Analyse af signalintensiteter afslørede, at det største antal differentielt udt…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Udtalelserne eller påstande, der er indeholdt heri, er de private synspunkter forfatternes og skal ikke opfattes som tjenestemand eller som afspejler de synspunkter, Department of the Army eller det amerikanske forsvarsministerium.
Denne forskning blev udført, mens forfatterne Whitney A. Greene, Alberto Muñiz og Ramesh R. Kaini afholdt en National Research Council postdoc Associateship på USAISR.
Microarray analyser blev udført af Greehey Børns Cancer Research Institute Microarray Core Facility og Bioinformatik Institut på UT Health Science Center i San Antonio.
Dette arbejde blev støttet af US Army Klinisk Rehabiliterende Medicin Research Program (CRMRP) og militære operationelle Medicine Research Program (MOMRP).
Materials
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Fetal RPE media RTEGM kit | Life Technologies | 195406 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Trypsin | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
| Miltenyi Biotec washing buffer | StemGent | 130-092-987 | |
| Miltenyi Biotec rinsing buffer | StemGent | 130-092-222 | |
| Anti-TRA-1-60 microbead kit | StemGent | 130-095-816 | |
| Miltenyi Biotec cell sorter column | StemGent | 130-021-101 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | |
| RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
| Human miRNA microarray v16 | Agilent | G4471A |
Riferimenti
- Yu, Z., et al. miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation. Front Genet. 3, 191 (2012).
- Romano, G., et al. A commentary on iPS cell biology: Potential applications in autologous tissue and cell transplantation, development of new models for the study of human pathological conditions and drug screening. J Cell Physiol. 229, 148-152 (2014).
- Almeida, P. E., et al. Immunogenicity of pluripotent stem cells and their derivatives. Circ Res. 112, 549-561 (2013).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2427-2434 (2009).
- Kokkinaki, M., et al. Human induced pluripotent stem-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells exhibit ion transport, membrane potential, polarized vascular endothelial growth factor secretion, and gene expression pattern similar to native RPE. Stem Cells. 29, 825-835 (2011).
- Bharti, K., et al. The new paradigm: retinal pigment epithelium cells generated from embryonic or induced pluripotent stem cells. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 21-34 (2011).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Pera, M. F. Stem cells. A new year and a new era. Nature. 451, 135-136 (2008).
- Subba Rao, M., et al. Thinking outside the liver: Induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19, 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50, 327-332 (2011).
- Lee, K. S., et al. Human sensory neurons derived from induced pluripotent stem cells support varicella-zoster virus infection. PLoS One. 7, (2012).
- Alipio, Z., et al. Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 13426-13431 (2010).
- la Cour, M., Tezel, T. The retinal pigment epithelium. Adv Organ Biol. 10, 253-272 (2005).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4, (2009).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, 713-720 (2012).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 198-209 (2014).
- Leonardo, T. R., et al. The functions of microRNAs in pluripotency and reprogramming. Nat Cell Biol. 14, 1114-1121 (2012).
- Arora, A., et al. Prediction of microRNAs affecting mRNA expression during retinal development. BMC Dev Biol. 10, (2010).
- Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat Rev Genet. 12, 99-110 (2011).
- Mallanna, S. K., Rizzino, A. Emerging roles of microRNAs in the control of embryonic stem cells and the generation of induced pluripotent stem cells. Dev Biol. 344, 16-25 (2010).
- Guo, H., et al. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466, 835-840 (2010).
- Adijanto, J., et al. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) promotes differentiation of human retinal pigment epithelium (RPE) by regulating microRNAs-204/211 expression. J Biol Chem. 287, 20491-20503 (2012).
- Hu, G., et al. Identification of miRNA signatures during the differentiation of hESCs into retinal pigment epithelial cells. PLoS One. 7, (2012).
- Wilson, K. D., et al. MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).
- Neveu, P., et al. MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states. Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).
- Qiagen, miRNeasy Mini Handbook. Sample and Assay Technologies. , (2013).
- . Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit. Agilent Technologies. , (2011).
- . Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2. Stem Cell Technologies. , (2010).
- . The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. About Biotechnology. , (2013).
