בנייה ואפיון של Bioreactor פולד רומן וקאלי
Summary
A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(ε-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.
Abstract
In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 µm. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.
Introduction
לקפל ווקאלית האנושית, מורכבת משכבת האפיתל, propria lamina (LP) ושרירי vocalis, הוא ברקמות רכות מיוחדות שממירה את זרימת אוויר מהריאות לגלים אקוסטיים להפקת צליל. 1 קפלי קול להתנדנד באופן קבוע במהלך phonation הנורמלי, תערוכת זנים של עד 30% בתדרים בסיסיים החל 100-300 הרץ. LP לקפל ווקאלית 2 מבוגרים הוא צבע מבנה מורכב משטחי (SLP), ביניים (ILP) ושכבה עמוקה (DLP). קבוצות נוספות סיווג האפיתל וSLP כשכבת רירית, ומשלבים את ILP וDLP לתוך הרצועה ווקאלי. 3 שכבת SLP מכילה בעיקר מטריקס אמורפי עם סיבי collagenous מפוזרים בדלילות, ואילו הרצועה מועשרת בקולגן בוגר וסיבים האלסטין כדי לספק כוח מספיק. 4 המבנה והמכניקה של קפלי קול יילוד להשתנות באופן משמעותי מעמיתיהם בוגרים שלהם. למרות שמנגנוןשל ויסות התפתחות לקפל ווקאלית והתבגרות עדיין לא מובן לחלוטין, ראיות ניסיוניות הצביעו על תפקידי ההגדרה של לחץ מכאני המופק מניקוד.
כמה מצבים רפואיים, ובכלל זה שימוש לרעה בקול, זיהומים, חומרים מגרים כימיים וניתוחים, עלולים לגרום נזק לקפל ווקאלית. הפרעות לקפל ווקאלית להשפיע 3-9% מאוכלוסיית ארה"ב. שיטות טיפול הנוכחיות להפרעות לקפל ווקאלית מוגבלות 5 וגישה הנדסית גזע מבוסס תאי רקמה התפתחה כאסטרטגיה מבטיחה לשחזור תפקוד לקפל ווקאלית. תאי גזע mesenchymal (MSCs) הם אלטרנטיבה מתאימה לfibroblasts לקפל ווקאלית העיקרית להנדסת רקמות לקפל ווקאלית. 6-9 מפרט גורל תאי גזע ופיתוח רקמות הבא מתווכים על ידי הנישה הספציפית שהם מתגוררים, אשר מצבו המכני הוא גורם חיוני. 10 כוחות מכאניים הם רגולטורים חיוניים של המורפוגנזה רקמהnd הומאוסטזיס, במיוחד לרקמות שנחשפות באופן שיגרתי לטעינה. 11 מנקודת מבט של הנדסת רקמות, זה כבר הוכיח כי חשיפה לגירויים פיזיולוגית מכאניים רלוונטיים מקדם גזע התמיינות תאים ושיפוץ מטריצת רקמות ספציפיות. 12-15
bioreactors תרבית רקמה נועדו לדמות את הסביבה הפיזיולוגית הרצויה לצמיחת תאים או רקמות במבחנה. להנדסת רקמות לקפל ווקאלית, זה קריטי במיוחד כדי לשחזר את הסביבה מכאנית של קפלי קול phonating. Bioreactor לקפל ווקאלית אידיאלית צריך למעשה לספק רמזי רטט לתאי תרבות, המאפשר שליטה קלילה על תדר, המשרעת ומשך זמן של תנודות. Titze ועמיתים לעבודה המציאו bioreactor וקאלי לקפל (bioreactor T1) 16 שמשלב מתיחה סטטית עם תדירות גבוהה (20-200 הרץ) תנודות כדי לעורר את הייצור של חלבוני מטריצה. מנצלגרם bioreactor זה, ווב ועמיתים 17 חקרו את ההשפעות של 10 יום, תנודות 100 הרץ על fibroblasts עורי בתרבית בחומצה היאלורונית (HA) מבוסס הידרוג'ל. מבני נתונים לרעידות הציגו ביטוי גבוה של HA synthase-2, decorin, fibromodulin ומטריקס metalloproteinase-1 (MMP1), ביחס לבקרות סטטי (HAS2). השפעות גירוי נמצאו להיות תלוי בזמן. לאחרונה, הקבוצה שלנו 18 התאסף bioreactor וקאלי לקפל (bioreactor J1) באמצעות מגבר כוח, מחוללים אותות, רמקול חזק ומוקף קרום סיליקון circumferentially מעוגני המעביר את אוויר נדנוד לתאים המצורפים. fibroblasts עורלת ילודים טיפח בbioreactor J1 היו נתונים לשעה 1 של רטט ב60, 110 או 300 הרץ, עם מתח במטוס של עד 0.05%. תוצאות qPCR הציעו כי הביטוי של גנים מסוימים ECM שונו באופן מתון בתגובה לתדרי רטט המגווניםואמפליטודות.
עיצובי bioreactor אלה, בעוד מסקרן, יש כמה מגבלות. לדוגמא, מערכת T1 דורשת מספר רב של מחברים וברים לצימוד מכאני, להגביל את התדרים מקסימאלי שניתן להשיג. יתר על כן, תאים עשויים להיות חשופים להפרעות חרדה ונוזל מכאניות בלתי רצויות שתסבכנה את פרשנות הנתונים. Bioreactor J1, לעומת זאת, מציג את יעילות המרת אנרגיה נמוכה יחסית ואינו ידידותי למשתמש. בנוסף, רטט בתדירות גבוהה מנתק את מבני התא עמוס מקרום סיליקון בסיסי. Bioreactor J2 לקפל ווקאלית שדווח כאן, שתוכנן על בסיס אותו העיקרון כמו גרסת J1, מותאם במיוחד עבור עקביות ושחזור. התנודות מחקה-phonation נוצרות מבחינה אווירודינמית בתאי רטט מותאמים באופן אישי שבו פולי MSC-מאוכלסים סיביים (ε-caprolactone) פיגומים (PCL) הם effectivהשיג איליי. הלייזר דופלר vibrometry (LDV) מאפשר למשתמש לאמת את פרופיל הרטט של ההרכבה קרום / פיגום. בהפגנה שלנו, MSCs חשופים לתנודות סינוסי 200 הרץ עם דפוס 1-HR-on-1-HR-off (של) עבור סכום כולל של שעות 12 ביום למשך 7 ימים. תגובות תאיות לרמזי רטט הוטלו נחקרות באופן שיטתי. בסך הכל, לקפל ווקאלית J2 מספק את התכונות הכי ידידותי למשתמש, המאפשר לימודי תרבות תא דינמי להתנהל בתפוקה גבוהה ואופנה לשחזור.
Protocol
Representative Results
Discussion
הנדסה מוצלחת של רקמות לקפל ווקאלית פונקציונליות במבחנה דורשת הבילוי של microenvironment כמו מתקפל קולני לתווך ההתנהגויות של תאי multipotent. הדעה מקובלת היא כי מבני רקמה או איבר משקפים את הפונקציות שהם נדרשים לבצע. 22 לרקמות לקפל ווקאלית, התנודות בתדירות גבוהות המתרחשו…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר ג'פרי קפלן לאימונים שלו וייעוץ על ההדמיה confocal. אנו מודים גם למעבדת קק מיקרוסקופית אלקטרונים וד"ר Chaoying Ni לקבלת סיוע SEM. עבודה זו ממומנת על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIDCD, R01DC008965 וR01DC011377). ABZ מודה אינטגרטיבית השכלה בוגרת ותכנית (IGERT) למימון המחקר Traineeship NSF.
Materials
| silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | cure the membrane at 100 C for 2 hr |
| PCL | Sigma Aldrich | 440744-500G | Mn ~ 80 kDa, dissolve overnight |
| chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| human bone marrow-derived MSCs | Lonza | PT-2501 | received with passage 2 |
| MSC maintenance media | Lonza | PT-3001 | 10% FBS in basal media supplemented with L-glutamine, gentamicin and amphotericin |
| Accutase cell dissociation reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| fibronectin | Sigma Aldrich | F2006-1MG | |
| MMP1 DuoSet ELISA kit | R&D systems | DY901 | |
| HA ELISA kit | Echelon Biosciences | K-1200 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| propidium iodide | Life Technologies | P1304MP | |
| Syto-13 | Life Technologies | S7575 | |
| QuantiTect reverse transcription kit | Qiagen | 205311 | |
| SYBR Green PCR master mix | Life Technologies | 4309155 | |
| replacement speaker | DAYTON audio (via Parts Express) |
DS90-8 | paper cone, full range (80-13000 Hz), 85dB |
| Ergo Micro torque screwdriver | Mountz | # 020377 | torque range: 20-120 cN.m |
| stereo speaker selector | RadioShack | 40-244 | maximum power handling 50 W |
| function generator | Agilent | 33220A | frequency range 1 µHz- 20 MHz |
| power amplifier | PYLE audio | PylePro PT2400 | frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker channels |
| cell culture incubator | Thermo Fisher | Steri-Cult 3307 | |
| syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| High voltage power supply | Spellman | CZE 1000R | output voltage: 0-30 kV |
| scanning electron microscope | JEOL-USA | JSM-7400F | |
| desk gold sputter coater | Denton Vacuum | DSK00V-0013 | |
| Doppler laser vibrometer | Polytec | PDV-100 | non-contact velocity measurement (0-22 kHz) |
| PCR sequence detection system | Applied Biosystems | ABI7300 | |
| multiphoton confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510Meta NLO | |
| UV-VIS Spectrophotometer | NanoDrop Products via Thermo Scientific |
ND-2000 | |
| VibSoft Data Acquisition Software | Polytec | acquisition bandwidth up to 40 MHz | |
| Origin 8.5 data analysis software | OriginLab | ||
| qbasePlus qPCR data analysis software | Biogazelle | V2.3 | |
| aluminium alloy | McMaster-Carr | Alloy 6061 | |
| acrylic blocks | McMaster-Carr | ||
| polycarbonate anti-humidity chamber | McMaster-Carr | Impact-Resistant Polycarbonate | |
| screws | McMaster-Carr | ||
| electronic cable/wire | |||
| medical grade PVC tubing | US Plastic Corp. | Tygon S-50-HL | clear, biocompatible |
| 10 mL syringe | Becton Dickinson | 309604 | |
| 21 G blunt ended needle | Small Parts | NE-213PL-25 | 1-1/2" length |
| Alligator clip adapters | RadioShack | 270-354 | fully insulated |
| 8 mm biopsy punch | Sklar Surgical Instruments | 96-1152 | sterile, disposable |
| 12 mm biopsy punch | Acuderm (via Fisher Scientific) | NC9998681 | |
| tissue culture flasks | Corning | cell culture treated |
Riferimenti
- Titze, I. R. Mechanical-Stress in Phonation. J. Voice. 8, 99-105 (1994).
- Titze, I. R. On the Relation Between Subglottal Pressure and Fundamental-Frequency in Phonation. J. Acoust. Soc. Am. 85, 901-906 (1989).
- Gray, S. D. Cellular physiology of the vocal folds. Otolaryngol. Clin. N. Am. 33, 679-698 (2000).
- Thibeault, S. L., Gray, S. D., Bless, D. M., Chan, R. W., Ford, C. N. Histologic and rheologic characterization of vocal fold scarring. J. Voice. 16, 96-104 (2002).
- Hansen, J. K., Thibeault, S. L. Current understanding and review of the literature: Vocal fold scarring. J. Voice. 20, 110-120 (2006).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Hanson, S. E., et al. Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Vocal Fold Fibroblasts. Laryngoscope. 120, 546-551 (2010).
- Tong, Z., Duncan, R. L., Jia, X. Modulating the behaviors of mesenchymal stem cells via the combination of high-frequency vibratory stimulations and fibrous scaffolds. Tissue Eng. Part A. 19, 1862-1878 (2013).
- Tong, Z., Sant, S., Khademhosseini, A., Jia, X. Controlling the Fibroblastic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Via the Combination of Fibrous Scaffolds and Connective Tissue Growth Factor. Tissue Eng. Part A. 17, 2773-2785 (2011).
- Jones, D. L., Wagers, A. J. No place like home: anatomy and function of the stem cell niche. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 11-21 (1038).
- Wang, J. H., Thampatty, B. P. Mechanobiology of Adult and Stem Cells. Int. Rev. of Cell Mol. Biol. 271, 301-346 (2008).
- Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly (ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Eng. Part A. 16, 3457-3466 (2010).
- Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue. Nat. Biotechnol. 17, 979-983 (1999).
- Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. J. Biomech. 39, 1136-1144 (2006).
- Kim, Y. J., Sah, R. L. Y., Grodzinsky, A. J., Plaas, A. H. K., Sandy, J. D. Mechanical Regulation of Cartilage Biosynthetic Behavior – Physical Stimuli.. Arch. Biochem. Biophys. 311, 1-12 (1994).
- Titze, I. R., et al. Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses. J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).
- Kutty, J. K., Webb, K. Vibration stimulates vocal mucosa-like matrix expression by hydrogel-encapsulated fibroblasts. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 62-72 (2010).
- Farran, A. J. E., et al. Design and Characterization of a Dynamic Vibrational Culture System. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2011).
- Reneker, D. H., Yarin, A. L. Electrospinning jets and polymer nanofibers. Polymer. 49, 2387-2425 (2008).
- Wang, Y., Theobald, P., Tyrer, J., Lepper, P. The application of scanning vibrometer in mapping ultrasound fields. J. Phys.: Conf. Ser. 1, 167-173 (2004).
- Brown, W. S., Morris, R. J., Hollien, H., Howell, E. Speaking Fundamental-Frequency Characteristics as a Function of Age and Professional. J. Voice. 5, 310-315 (1991).
- Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. Faseb J. 20, 811-827 (2006).
- Titze, I. R., et al. Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses. J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).
- Moore, J., Thibeault, S. Insights Into the Role of Elastin in Vocal Fold Health and Disease. J. Voice. 26, 269-275 (2012).
- Thibeault, S. L., Bless, D. M., Gray, S. D. Interstitial protein alterations in rabbit vocal fold with scar. J. Voice. 17, 377-383 (2003).
- Branski, R. C., Verdolini, K., Sandulache, V., Rosen, C. A., Hebda, P. A. Vocal fold wound healing: A review for clinicians. J. Voice. 20, 432-442 (2006).
- Clark, I. A., Swingler, T. E., Sampieri, C. L., Edwards, D. R. The regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors. Int. J. Biochem. Cell B. 40, 1362-1378 (2008).
- Silver, F. H., Horvath, I., Foran, D. J. Viscoelasticity of the vessel wall: The role of collagen and elastic fibers. Crit. Rev. Biomed. Eng. 29, 279-301 (2001).
- Kutty, J. K., Webb, K. Tissue Engineering Therapies for the Vocal Fold Lamina Propria. Tissue Eng. Part B: Rev. 15, 249-262 (2009).
