عكس النهج الوراثية عن طريق القلب البطيني Morpholino حقن لبالنقل متعددة يصعب الهدف الأنسجة في الزرد اليرقة
Summary
طريقة الوراثية العكسية للتكيف الزرد لتقييم وظيفة الجين خلال مراحل لاحقة من التطور والتوازن الفسيولوجية مثل تجديد الأنسجة باستخدام الحقن داخل البطينات من morpholinos الجينات المحددة.
Abstract
الزرد هو نموذج مهم لفهم الخلية والبيولوجيا الجزيئية من الجهاز وأطرافهم التجدد. ومع ذلك، استراتيجيات لتوظيف الجزيئية وعلم الوراثة العكسية لم يتم تطويرها بشكل كاف لتقييم وظيفة الجين في تجديد أو توازن الأنسجة أثناء مراحل اليرقات بعد مرحلة التطور الجنيني الزرد، والعديد من الأنسجة داخل اليرقة الزرد يصعب استهدافها. الحقن داخل البطينات من morpholinos الجينات المحددة تقدم طريقة بديلة لعدم القدرة الحالية لاستهداف genomically الجينات الزرد في الطريقة التي تسيطر عليها مؤقتا في هذه المراحل. يسمح هذا الأسلوب لتشتت كاملة والتأسيس لاحقة من morpholino في الأنسجة المختلفة في جميع أنحاء الجسم، بما في ذلك الهياكل التي كانت في السابق من المستحيل التوصل إلى مثل تلك الموجودة في الزعنفة الذيلية اليرقات، بنية غالبا ما تستخدم للبحث noninvasively تجديد الأنسجة. وحاضرا أيضا العديد من الجينات تفعيلها خلال اليرقات finfold التجديدر في تجديد الأنسجة الفقاريات الكبار، وبالتالي فإن اليرقة هو نموذجا مفيدا لفهم التجديد في البالغين. يسمح هذا الأسلوب morpholino التشتت لتحديد سريعة وسهلة من الجينات المطلوبة لتجديد أنسجة اليرقات وكذلك الظواهر الفسيولوجية الأخرى التي تنظم توازن الأنسجة بعد مرحلة التطور الجنيني. لذلك، يوفر هذا الأسلوب تسليم استراتيجية حاجة حاليا للسيطرة الزمني لتقييم وظيفة الجين بعد مرحلة التطور الجنيني.
Introduction
تجديد الأجهزة والزوائد المهم بشكل أساسي من أجل البقاء واللياقة البدنية؛ ومع ذلك، العديد من الفقاريات بما في ذلك رجل حدت قدرات التجدد. بينما توجد العديد من النماذج الحيوانية التي لديها القدرة على التجدد واسعة، عكس التقنيات الوراثية لتقييم وظيفة الجين خلال الجهاز وأطرافهم التجديد تبقى محدودة جدا أو غير موجودة. لذا، ثمة حاجة إلى نهج جديد لتشريح البيولوجيا الجزيئية للتجديد في هذه الكائنات الطراز.
الزرد هو نموذج راسخة لفهم الخلية والبيولوجيا الجزيئية من الجهاز وأطرافهم تجديد 1، وليس فقط بسبب قدرة كبيرة لتجديد أجهزة متعددة والأنسجة والزوائد، ولكن أيضا لأن العديد من خطوط الأسماك المعدلة وراثيا موجودة لتعقب الخلايا و لoverexpress الجينات يبني 2، 3. ومع ذلك، وتثبيط الجينات في الزرد اليرقات يقتصر أساسا إلى overexpression من بنيات المهيمنة على السلبية، والتي ليست متاحة لجميع الجينات في المصالح أو التي يمكن الحصول على مكاسب من وظيفة الآثار التي لا تعكس النشاط الذاتية من الجين المنتج التحوير. وبالتالي، هناك حاجة إلى طريقة بديلة لإزالة تحديدا التعبير الجيني بالضربة القاضية أو ضربة قاضية للتغلب على هذه القضايا.
الجينات المحددة التي تستهدف استخدام TALENS موجود كوسيلة الوراثية العكسية لبالضربة القاضية وظيفة الجين؛ ومع ذلك، فإن هذه الاستراتيجية هو خروج المغلوب محدودة جدا في كثير من الأحيان إلى عمليات تقييم وظيفية خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر، لأن الاحتياجات الأولية من الجين منع المزيد من التقدم من التطور الجنيني. وبالتالي، دراسة الظواهر في وقت لاحق مثل تجديد أو توازن الجهاز بعد التطوير باستخدام TALENS تنتفي صفة 4، 5. وبالتالي، هناك حاجة إلى الجين استراتيجية إزالة البديلة التي تستهدف وظيفة الجين بعد التنمية في وقت مبكر لتقييم متطلبات الجينات في الأجهزة والهياكل تشكيلها بالكامل. </ع>
وقد تبين Morpholino الحقن لتكون فعالة في استهداف الجينات في عدد قليل من أجهزة الكبار والكبار تجديد زعنفة 6-8، ولكن هذه الأساليب تتطلب التثقيب الكهربائي والعديد من الأعضاء الداخلية يصعب ل electroporate إما بسبب موقعها أو بسبب حساسيتها للالكهربائية انقطاع. علاوة على ذلك، بعض الأنسجة في يرقة يصعب حقن مباشر، وذلك لأن الحقن المباشر قد يعطل السلامة الهيكلية أو بسبب حجمها يحد. الزعنفة الذيلية لليرقة واحدة من هذه البنية، لأن الحقن المباشر في finfold غير ممكن. وبالتالي، هناك حاجة إلى بديل لالتثقيب الكهربائي والحقن المباشر لاستهداف الجينات في الأنسجة التي إما أن تكون صغيرة جدا لحقن أو لا يمكن electroporated.
من أجل استهداف وتمنع وظيفة جينات معينة خلال تجديد الزعنفة الذيلية اليرقات، ونحن قد عدلت التقنيات morpholino القائمة السماح لssessment من خلال تجديد وظيفة الجين الزعنفة الذيلية في وقت متأخر من مراحل اليرقة. هذا الأسلوب يعمل داخل البطيني تسليم 9 من بين فلوريسئين الموسومة morpholinos جنبا إلى جنب مع إندو بورتر ترنسفكأيشن الكاشف 10. مرة واحدة في البطين، خليط morpholino-إندو بورتر ينتشر بسرعة في جميع انحاء اليرقة عن طريق الأوعية الدموية ويدخل الأنسجة التي كان من المستحيل سابقا لاستهداف. هذه الطريقة حقن يجوز تعديل لاستهداف الجينات في أنسجة معينة وربما الى حد بعيد يمكن تطبيقها في النماذج الحيوانية الأخرى التي تفتقر حاليا أساليب الوراثية العكسية لتثبيط وظيفة الجينات. وبالتالي، فإنه يوفر طريقة سريعة وسهلة مع إمكانية استخدام مجموعة واسعة لدراسة وظيفة الجين على الفور خلال توازن الجهاز عامة والتجديد في مراحل اليرقات.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر حقن داخل البطيني طريقة تقييم سريع وموثوق بها لاختبار وظيفة الجين في مراحل لاحقة من التطور أو من التوازن الجسم دون التأثير على وظيفة الجين خلال مرحلة التطور الجنيني. لضمان نجاح هذه التقنية، ينبغي للمرء أن يكون على بينة من أربع نقاط هامة: 1) حجم الإبرة، 2) التجفيف من…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG)، ونحن نود أن نشكر أييلي تسيديكي Taddese للدعم التقني.
Materials
| Company | Catalog Number | Comments/Description | |
| Reagent/Material | |||
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information on www.genetools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information on www.genetools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricane (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSo4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Equipment | |||
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming / Brown needle puller | Sutter | More information on www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
Riferimenti
- Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6, 2011 (1998).
- Skromne, I., Prince, V. E. Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward. Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491, 114-118 (2012).
- Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. , (2013).
- Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. , (2012).
- Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. , (2011).
- Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).
- Madhavan, M., et al. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).
- Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. . Zebrafish: a practical approach. 261, 121-143 (2000).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don’t stop making antisense. Development. 135, 1735-1743 (2008).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Hyatt, T. M., Ekker, S. C. Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish. Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish. PLoS One. 4, (2009).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Liu, S., D, L. S. Zebrafish models for cancer. Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).
- Stoick-Cooper, C. L., et al. Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration. Development. 134, 479-489 (2007).
- Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins. BMC Dev. Biol. 13, (2013).
- McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice. Science. 241, 837-839 (1988).
- Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D’Eustachio, P., Mintz, B. Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos. Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).
