Omvendt Genetisk Morpholino tilgang med kardiel ventrikulær Injection til transfektion flere vanskelige at target væv i zebrafisk Larva
Summary
En tilpasningsdygtig reverse genetisk metode til zebrafisk til at vurdere gen funktion under senere stadier af udvikling og fysiologiske homeostase såsom væv regenerering hjælp intraventrikulære injektioner af gen-specifikke morpholinos.
Abstract
Zebrafisk er en vigtig model for at forstå cellen og molekylærbiologi orgel og vedhæng regenerering. Men molekylære strategier til at ansætte revers genetik er endnu ikke blevet tilstrækkeligt udviklet til at vurdere genfunktion i regenerering eller vævshomeostase under larvestadier efter zebrafisk embryogenese, og flere væv i zebrafisk larve er vanskelige at målrette. Intraventrikulære indsprøjtninger af genspecifikke morpholinos tilbyder en alternativ metode til den nuværende manglende evne til at genomically målrette zebrafisk gener i en tidsmæssigt kontrolleret måde på disse stadier. Denne fremgangsmåde giver mulighed for fuldstændig dispergering og efterfølgende inkorporering af morpholino i forskellige væv i hele kroppen, herunder strukturer, der tidligere var umuligt at nå som de i larvestadiet halefinnen en struktur, der ofte anvendes til ikke-invasivt at forske vævsregeneration. Flere gener aktiveres under larvestadiet finfold regenerering også præsent regenerere voksen hvirveldyr væv, så larven er en nyttig model til at forstå regenerering hos voksne. Denne morpholino dispersion metode giver mulighed for hurtig og nem identifikation af gener, der er nødvendige for regenerering af larvernes væv samt andre fysiologiske fænomener, der regulerer vævshomeostase efter embryogenese. Derfor er denne leverance metode giver et aktuelt behov for strategi for tidsmæssig kontrol til evaluering af gen-funktion efter embryogenese.
Introduction
Regeneration af organer og lemmer er fundamentalt vigtig for overlevelse og fitness; Imidlertid har flere hvirveldyr, herunder mennesket begrænset regenerative evner. Mens flere dyremodeller findes, der har omfattende regenerationsevne, reverse genetiske teknikker til at vurdere gen funktion under orgel og vedhæng regenerering fortsat er meget begrænset eller ikke-eksisterende. Derfor er nye metoder påkrævet for at dissekere molekylærbiologi regenerering i disse modelorganismer.
Zebrafisken er en veletableret model for forståelse af cellen og molekylær biologi orgel og vedhæng regenerering 1, ikke kun på grund af sin betydelige evne til at regenerere flere organer, væv og vedhæng, men også fordi flere transgene fisk linjer eksisterer for at spore celler og at overudtrykke genkonstruktioner 2, 3. Dog er gen hæmning i larvernes zebrafisk hovedsagelig begrænset til overexpression af dominerende-negative konstruktioner, som ikke er tilgængelige for alle gener af interesse, eller hvis transgen produkt kan erhverve gain-of-funktion effekter, der ikke afspejler den endogene aktivitet af genet. Således er der behov for en alternativ metode til specifikt at fjerne genekspression ved knockout eller knockdown at overvinde disse problemer.
Gene målretning hjælp TALENS eksisterer som en omvendt genetiske middel til knockout-gen funktion; men denne knockout strategi er meget ofte begrænset til funktionelle vurderinger under tidlig embryogenese, da de oprindelige krav af genet forhindre yderligere progression af fosterudviklingen. Således studere senere fænomener som regenerering eller orgel homeostase efter udvikling ved hjælp TALENS er udelukket 4, 5. Derfor er der behov for en alternativ gen fjernelse strategi, der er målrettet gen funktion efter tidlig udvikling for at vurdere gen krav fuldt dannede organer og strukturer. </p>
Morpholino injektion har vist sig at være effektiv i at målrette gener i et par voksne organer, og den voksne regenererende fin 6-8, men disse metoder kræver elektroporering og mange indre organer er vanskelige at elektroporere enten på grund af deres placering eller på grund af deres følsomhed over for elektrisk forstyrrelser. Desuden er det vanskeligt at injicere direkte nogle væv i larve, fordi direkte injektion kan forstyrre deres strukturelle integritet eller fordi deres størrelse er begrænsende. Halefinnen af larve er en sådan struktur, fordi direkte injektion i finfold er ikke mulig. Blev således behov for et alternativ til elektroporation og direkte indsprøjtning til at målrette gener i væv, der enten er for lille til at injicere eller ikke kan elektroporeret.
For at målrette og inhibere funktionen af specifikke gener under regenerering af larvestadiet halefinnen, har vi modificeret eksisterende morpholino teknologier gør det muligt for enURDERING af gen-funktion under halefinne regenerering i sen-iscenesat larve. Denne metode anvender intraventrikulær levering 9 i fluorescein-mærkede morpholinos sammen med Endo-Porter-transfektionsreagens 10. Når i ventrikel, morpholino-Endo-Porter-blanding hurtigt breder sig i hele larve via karrene og går væv, der tidligere har været umuligt at målrette. Denne injektion metode kan ændres til at målrette gener i specifikke væv og muligvis kan anvendes i andre dyremodeller, der i øjeblikket mangler reverse genetiske metoder til at hæmme genfunktion. Således, det giver en hurtig og nem metode med potentiale for bred vifte brug for straks at studere gen funktion under generel orgel homeostase og regenerering ved larvestadier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den intraventrikulær indsprøjtning giver en hurtig og pålidelig vurdering metode til afprøvning af gen funktion på senere stadier af udvikling eller af kroppens homeostase uden at påvirke gen-funktionen under embryogenese. For at sikre succes af denne teknik, skal man være opmærksom på fire kritiske punkter: 1) pinde, 2) udtørring af nålen, 3) at minimere volumen, og 4) minimal eksponering tid i sedation løsning. Nåle, der er for lille, vil tilstoppe hyppigt, idet nåle, der er for store, vil beskadige vent…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), ønsker vi at takke Ayele Tsedeke Taddese for teknisk support.
Materials
| Company | Catalog Number | Comments/Description | |
| Reagent/Material | |||
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information on www.genetools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information on www.genetools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricane (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSo4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Equipment | |||
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming / Brown needle puller | Sutter | More information on www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
Riferimenti
- Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6, 2011 (1998).
- Skromne, I., Prince, V. E. Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward. Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491, 114-118 (2012).
- Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. , (2013).
- Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. , (2012).
- Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. , (2011).
- Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).
- Madhavan, M., et al. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).
- Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. . Zebrafish: a practical approach. 261, 121-143 (2000).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don’t stop making antisense. Development. 135, 1735-1743 (2008).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Hyatt, T. M., Ekker, S. C. Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish. Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish. PLoS One. 4, (2009).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Liu, S., D, L. S. Zebrafish models for cancer. Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).
- Stoick-Cooper, C. L., et al. Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration. Development. 134, 479-489 (2007).
- Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins. BMC Dev. Biol. 13, (2013).
- McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice. Science. 241, 837-839 (1988).
- Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D’Eustachio, P., Mintz, B. Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos. Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).
