Reverse Genetische Morfolino benadering met behulp van de cardiale ventriculaire Injection naar meerdere Moeilijk-to-target weefsels in de zebravis Larve Transfecteren
Summary
Een flexibel omgekeerde genetische methode voor zebravis over gen-functie te beoordelen tijdens de latere stadia van ontwikkeling en fysiologische homeostase zoals weefselregeneratie behulp intraventriculaire injecties van gen-specifieke morpholinos.
Abstract
De zebravis is een belangrijk model voor de cel-en moleculaire biologie van orgaan-en aanhangsel regeneratie begrijpen. Echter, moleculaire strategieën reverse genetics dienst nog niet voldoende ontwikkeld om genfunctie in regeneratie of weefsel homeostase in larvale stadia na de zebravis embryogenese beoordelen en verscheidene weefsels in het zebravis larven zijn moeilijk te richten. Intraventriculaire injectie van genspecifieke morfolino een alternatieve werkwijze voor de huidige onmogelijkheid om genomisch doel zebravis genen in een tijdelijk geregelde wijze naar deze fasen. Deze methode zorgt voor volledige dispersie en daaropvolgende verwerking van de morfolino in verschillende weefsels in het lichaam, waaronder structuren die voorheen onmogelijk te bereiken als die in de larvale staartvin een structuur vaak gebruikt om niet-invasief onderzoek weefselregeneratie waren. Verschillende genen tijdens de larvale finfold regeneratie geactiveerd worden ook presentatiet in regenererende volwassen gewervelde weefsels, zodat de larve is een bruikbaar model voor regeneratie begrijpen bij volwassenen. Deze morfolino dispersie methode maakt een snelle en gemakkelijke identificatie van genen die vereist zijn voor de regeneratie van larvale weefsels en andere fysiologische verschijnselen reguleren weefsel homeostase na embryogenese. Daarom deze levering methode een nog nodig strategie voor tijdelijke controle van de evaluatie van genfunctie na embryogenese.
Introduction
Regeneratie van organen en appendages is van fundamenteel belang voor de overleving en fitness; hebben echter een aantal gewervelde dieren, inclusief de mens regeneratieve vermogens beperkt. Terwijl verschillende diermodellen bestaan die uitgebreide regeneratieve capaciteit hebben, omgekeerde genetische technieken om gen-functie te beoordelen tijdens orgel en aanhangsel regeneratie blijven zeer beperkt of niet aanwezig. Daarom zijn nieuwe benaderingen nodig om de moleculaire biologie van regeneratie ontleden in deze modelorganismen.
De zebravis is een goed uitgewerkt model voor het begrijpen van de cellulaire en moleculaire biologie van orgaan-en aanhangsel regeneratie 1, niet alleen vanwege de belangrijke mogelijkheid om meerdere organen, weefsels en appendages regenereren, maar ook omdat een aantal transgene vis lijnen bestaan om cellen te volgen en Gene overexpressie constructen 2, 3. Echter remming gen larvale zebravis grotendeels beperkt tot de overexpression van dominant-negatieve constructen, die niet voor alle genen van belang of waarvan transgen product gain-of-function effecten die niet weergeven endogene activiteit van het gen te verwerven. Aldus wordt een alternatieve methode om specifiek verwijderen genexpressie door knockout of knockdown nodig om deze problemen te overwinnen.
Gen-specifieke sturing met TALENS bestaat als een reverse genetische middel om genfunctie knockout; Maar dit knockout strategie is zeer vaak beperkt tot functionele evaluaties tijdens vroege embryogenese omdat basisvereisten van het gen voorkomen verdere progressie van de embryonale ontwikkeling. Zo bestuderen later verschijnselen zoals regeneratie of orgaan homeostase na ontwikkeling met behulp van TALENS uitgesloten 4, 5. Daarom is een alternatieve strategie voor de verwijdering gen nodig die genfunctie richt na de vroege ontwikkeling gen eisen volledig gevormd organen en structuren beoordelen. </p>
Morfolino injectie is effectief gebleken in het richten genen in een aantal volwassen organen en de volwassen regenereren vin 6-8 zijn, maar deze methoden elektroporatie en vele interne organen zijn moeilijk te electroporate hetzij als gevolg van hun locatie of vanwege hun gevoeligheid voor elektrische verstoring. Bovendien zijn sommige weefsels in de larve zijn moeilijk direct te injecteren, omdat directe injectie de structurele integriteit kan verstoren of omdat hun omvang is beperkt. De staartvin van de larve is een dergelijke structuur, omdat directe injectie in de finfold niet mogelijk. Dus een alternatief voor elektroporatie en directe injectie noodzakelijk om genen te richten in weefsels die ofwel te klein om te injecteren of kan niet worden geëlektroporeerd.
Om richten en remmen de functie van specifieke genen tijdens de regeneratie van de larvale staartvin, hebben wij bestaande technologieën morfolino gemodificeerd zodat het eenEOORDELING van gen-functie tijdens staartvin regeneratie in late-geënsceneerde larve. Deze methode maakt gebruik van intraventriculaire aflevering 9 van fluoresceïne-gelabeld morpholinos samen met Endo-Porter transfectiereagens 10. Eenmaal in het ventrikel, de morfolino-Endo-Porter mengsel verspreidt zich snel gedurende de larve via de vasculatuur en gaat weefsels die voorheen onmogelijk te richten zijn. Deze injectie werkwijze kan worden gemodificeerd om genen te richten op specifieke weefsels en mogelijk kan ook in diermodellen die nog onvoldoende omgekeerde genetische methoden om genfunctie te remmen worden toegepast. Zo, het biedt een snelle en eenvoudige methode met het potentieel voor brede waaier gebruik onmiddellijk te bestuderen gen-functie tijdens algemene orgel homeostase en regeneratie bij larvale stadia.
Protocol
Representative Results
Discussion
De intraventriculaire injectie zorgt voor een snelle en betrouwbare beoordeling methode voor het testen van gen-functie in latere stadia van ontwikkeling of van het lichaam homeostase zonder dat de functie van een gen tijdens de embryogenese. Om het succes van deze techniek te waarborgen, moet men zich bewust zijn van de vier kritische punten: 1) met nld, 2) uitdrogen van de naald, 3) een minimaal volume en 4) minimale blootstelling tijd in de sedatie oplossing. Naalden die te klein zijn zal vaak verstoppen, terwijl de …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), willen we Ayele Tsedeke Taddese bedanken voor de technische ondersteuning.
Materials
| Company | Catalog Number | Comments/Description | |
| Reagent/Material | |||
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information on www.genetools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information on www.genetools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricane (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSo4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Equipment | |||
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming / Brown needle puller | Sutter | More information on www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
Riferimenti
- Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6, 2011 (1998).
- Skromne, I., Prince, V. E. Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward. Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491, 114-118 (2012).
- Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. , (2013).
- Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. , (2012).
- Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. , (2011).
- Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).
- Madhavan, M., et al. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).
- Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. . Zebrafish: a practical approach. 261, 121-143 (2000).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don’t stop making antisense. Development. 135, 1735-1743 (2008).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Hyatt, T. M., Ekker, S. C. Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish. Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish. PLoS One. 4, (2009).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Liu, S., D, L. S. Zebrafish models for cancer. Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).
- Stoick-Cooper, C. L., et al. Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration. Development. 134, 479-489 (2007).
- Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins. BMC Dev. Biol. 13, (2013).
- McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice. Science. 241, 837-839 (1988).
- Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D’Eustachio, P., Mintz, B. Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos. Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).
