Reverter Genética Abordagem Morfolino Usando Injeção Cardíaca Ventricular para transf múltiplos tecidos de difícil alvo do Zebrafish Zergling
Summary
Um método de genética reversa adaptável para peixe-zebra para avaliar a função do gene em fases posteriores do desenvolvimento e homeostase fisiológica, como a regeneração do tecido usando injeções intraventricular de morpholinos gene-específicos.
Abstract
O peixe-zebra é um modelo importante para entender a biologia celular e molecular do órgão e regeneração apêndice. Contudo, as estratégias moleculares para empregar genética reversa ainda não foram adequadamente desenvolvidos para avaliar a função do gene em regeneração ou homeostase do tecido durante a fase larval após embriogênese peixe-zebra, e vários tecidos dentro do larva zebrafish são difíceis de atingir. Injecções intraventriculares morpholinos gene-específicos oferecer um método alternativo para a actual incapacidade para alvejar genes genomicamente de peixes-zebra de uma forma temporal controlada nestas fases. Este método permite a completa dispersão e subsequente incorporação da morfolino em diversos tecidos em todo o corpo, incluindo as estruturas que eram anteriormente impossíveis de alcançar, tais como os do caudal das larvas, de uma estrutura, muitas vezes utilizados para pesquisar de forma não invasiva a regeneração do tecido. Vários genes ativados durante a regeneração membrana embrionária larval também são apresent na regeneração de tecidos adultos de vertebrados, de modo a larva é um modelo útil para compreender a regeneração em adultos. Este método de dispersão morfolino permite a identificação rápida e fácil dos genes necessários para a regeneração dos tecidos das larvas, bem como outros fenómenos fisiológicos que regulam a homeostase do tecido após a embriogénese. Portanto, este método de entrega fornece uma estratégia atualmente necessário para controle temporal para a avaliação da função do gene após a embriogênese.
Introduction
A regeneração de órgãos e apêndices é de fundamental importância para a sobrevivência e fitness; no entanto, vários vertebrados, incluindo o homem limitaram capacidades regenerativas. Embora existam vários modelos animais que têm ampla capacidade regenerativa, inverter técnicas genéticas para avaliar a função do gene durante o órgão e regeneração apêndice continuam a ser muito limitada ou inexistente. Por conseguinte, novas abordagens são necessárias para dissecar a biologia molecular de regeneração nestes organismos modelo.
O peixe-zebra é um modelo bem estabelecido para a compreensão da biologia celular e molecular do órgão e regeneração apêndice 1, não só devido à sua significativa capacidade de regenerar vários órgãos, tecidos e apêndices, mas também porque existem várias linhas de peixes transgênicos para rastrear células e para sobre-expressar genes constrói 2, 3. No entanto, a inibição do gene em peixes-zebra larval é limitada principalmente ao overexpression de construções dominantes-negativas, que não estão disponíveis para todos os genes de interesse ou cujo produto transgene pode adquirir efeitos ganho de função que não refletem a atividade endógena do gene. Assim, um método alternativo para remover especificamente expressão gênica por nocaute ou nocaute é necessária para superar esses problemas.
Específica do gene alvo usando TALENS existe como um meio genéticos reversa para nocautear a função do gene; no entanto, esta estratégia de nocaute é muito frequentemente limitado a avaliação funcional durante a embriogênese cedo, porque os requisitos iniciais do gene impedir a progressão do desenvolvimento embrionário. Assim, o estudo de fenômenos posteriores, como a regeneração ou a homeostase do órgão após o desenvolvimento usando TALENS é impedida 4, 5. Portanto, uma estratégia alternativa de remoção de gene é necessário que atinge a função do gene após o desenvolvimento cedo para avaliar os requisitos de genes em órgãos e estruturas totalmente formados. </p>
Morfolino injecção foi demonstrado ser eficaz no direccionamento de genes em alguns órgãos adultos e adultos regenerar barbatana 6-8, mas estes métodos requerem a electroporação e muitos órgãos internos são difíceis para electroporar, quer devido à sua localização, ou devido à sua sensibilidade à eléctrica perturbação. Além disso, alguns tecidos, em que a larva são difíceis de administrar directamente, devido à injecção directa pode perturbar a sua integridade estrutural ou porque o seu tamanho é limitante. O caudal da larva é uma estrutura deste tipo, porque a injecção directa na membrana embrionária não é possível. Assim, foi necessária uma alternativa para eletroporação e injeção direta para atingir genes em tecidos que são demasiado pequenos para injetar ou não pode ser eletroporados.
A fim de orientar e inibir a função de genes específicos durante a regeneração da nadadeira caudal larval, modificamos tecnologias morpholino existentes permitindo a umAVALIAÇÃO da função do gene durante a regeneração da nadadeira caudal em larva late-encenado. Este método emprega entrega intraventricular 9 de fluoresceína-marcado morpholinos juntamente com Endo-Porter reagente de transfecção 10. Uma vez no interior do ventrículo, a mistura de morfolino-Endo-Porter espalha-se rapidamente por toda a larva através da vasculatura e entra tecidos que tenham sido previamente impossível de atingir. Este método de injecção pode ser modificado para alvejar genes em tecidos específicos e, possivelmente, pode ser aplicado em outros modelos animais, que não têm ainda métodos de genética inversa para inibir a função do gene. Assim, oferece um método rápido e fácil com o potencial para uso amplo leque de estudar imediatamente a função do gene durante a homeostase órgão geral e regeneração em estágios larvais.
Protocol
Representative Results
Discussion
A injeção intraventricular fornece um método de avaliação rápida e confiável para testar a função do gene em fases posteriores do desenvolvimento ou da homeostase corporal sem afetar a função dos genes durante a embriogênese. Para garantir o sucesso desta técnica, deve-se estar ciente de quatro pontos fundamentais: 1) tamanho da agulha, 2) secagem para fora da agulha, 3) minimizar o volume, e 4) tempo de exposição mínimo na solução de sedação. Agulhas que são demasiado pequenos vai entupir com freq?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), queremos agradecer Ayele Tsedeke Taddese para suporte técnico.
Materials
| Company | Catalog Number | Comments/Description | |
| Reagent/Material | |||
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information on www.genetools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information on www.genetools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricane (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSo4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Equipment | |||
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming / Brown needle puller | Sutter | More information on www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
Riferimenti
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