Omvänd Genetisk Morfolino Approach Använda Cardiac ventrikulär injektion att transfektera flera svår mål vävnader i Zebrafish Larva
Summary
En anpassningsbar omvända genetisk metod för zebrafisk att bedöma geners funktion under senare stadier av utveckling och fysiologiska homeostas t.ex. vävnadsregenerering med hjälp intraventrikulära injektioner av genspecifika morpholinos.
Abstract
Den zebrafisk är en viktig modell för att förstå den cell-och molekylärbiologi för orgel och bihang förnyelse. Men molekylära strategier för att anställa omvänd genetik ännu inte har utvecklats tillräckligt för att bedöma geners funktion i regeneration eller vävnad homeostas under larvstadier efter zebrafisk embryogenes, och flera vävnader i zebrafisk larv är svåra att rikta. Intraventrikulära injektioner av genspecifika morpholinos erbjuda en alternativ metod för aktuell oförmåga att genomiskt rikta zebrafisk gener i ett tidsmässigt kontrollerat sätt vid dessa etapper. Denna metod möjliggör fullständig dispergering och efterföljande inkorporering av morpholino i olika vävnader i hela kroppen, inklusive strukturer som tidigare var omöjligt att nå som de i larv stjärtfenan, en struktur som ofta används för att icke-invasivt forskning vävnadsregenerering. Flera gener som aktiveras under larv finfold regenere också presenti regenere vuxen ryggradsdjur vävnader, så att larven är en användbar modell för att förstå regeneration hos vuxna. Denna morpholino spridningsmetod gör det möjligt att snabbt och enkelt identifiera gener som krävs för regenerering av larver vävnader samt andra fysiologiska fenomen som reglerar vävnad homeostas efter embryogenes. Därför ger denna leveransmetod ett omedelbart behov strategi för tidsstyrning till utvärderingen av geners funktion efter embryogenes.
Introduction
Regenerering av organ och bihang är fundamentalt viktigt för överlevnad och kondition; dock har flera ryggradsdjur inklusive människa begränsad regenerativ förmåga. Medan flera djurmodeller finns som har omfattande förnyelseförmåga, vända genteknik för att bedöma geners funktion under orgel och bihang förnyelse förblir mycket begränsad eller obefintlig. Därför är nya metoder som krävs för att dissekera den molekylära biologin av förnyelse i dessa modellorganismer.
Den zebrafisk är en väl etablerad modell för att förstå den cell-och molekylärbiologi för orgel och bihang förnyelse 1, inte bara på grund av dess betydande förmåga att regenerera flera organ, vävnader och bihang, utan också för att flera transgena fiskar linjer finns för att spåra celler och för att överuttrycka genen konstruerar 2, 3. Dock är gen inhibition i larver zebrafisk huvudsakligen begränsat till overexpression dominerande-negativa konstruktioner, som inte är tillgängliga för alla gener av intresse eller vars transgenprodukten kan få vinst-av-funktion effekter som inte speglar den endogena aktiviteten av genen. Således behövs en alternativ metod för att specifikt avlägsna genexpression genom knockout eller knockdown för att övervinna dessa problem.
Gene-specifik inriktning med hjälp TALENS existerar som en omvänd genetiska sätt att knockout geners funktion; dock denna knockout strategi ofta begränsade till funktionella bedömningar under tidig embryogenes, eftersom ursprungliga kraven av genen förhindra ytterligare progression av embryonal utveckling. Således, studera senare fenomen som återvinning eller organ homeostas efter utveckling med TALENS är utesluten 4, 5. Därför behövs en alternativ gen borttagning strategi som riktar geners funktion efter tidig utveckling för att bedöma gen krav fullt utvecklade organ och strukturer. </p>
Morfolino injektionen har visat sig vara effektiva för riktad genmodifiering i några vuxna organ och den vuxna regenere fin 6-8, men dessa metoder kräver elektroporation och många inre organ är svåra att electroporate antingen på grund av deras läge eller på grund av deras känslighet för elektriska störningar. Dessutom vissa vävnader i larven är svåra att injicera direkt, eftersom direktinsprutning kan störa deras strukturella integritet eller för att deras storlek är begränsande. Stjärtfenan av larven är en sådan struktur, eftersom direkt injektion i finfold är inte möjlig. Således var ett alternativ till elektroporation och direktinsprutning som behövs för att rikta gener i vävnader som är för små för att injicera eller inte kan elektroporerade.
För att rikta och hämmar funktionen av specifika gener under regenerering av larver stjärtfenan, har vi modifierat befintliga morfolinogrupper teknik gör det möjligt för enEDÖMNING av geners funktion under stjärtfenan förnyelse i sen-iscensatt larv. Denna metod använder intraventrikulär leverans 9 av fluorescein-märkta morpholinos tillsammans med Endo-Porter transfektionsreagens 10. Väl i ventrikeln, sprider morfolino-Endo-Porter blandningen snabbt genom hela larv via vaskulaturen och inträder vävnader som har tidigare varit omöjligt att rikta. Denna injektion metod kan modifieras för att rikta gener i specifika vävnader och kanske kan tillämpas i andra djurmodeller som idag saknar omvända genetiska metoder för att hämma geners funktion. Således ger det en snabb och enkel metod med potential för bred användning för att omedelbart studera geners funktion under allmän organ homeostas och regenerering vid larvstadier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den intraventrikulär injektion ger en snabb och tillförlitlig metod för att pröva geners funktion i senare skeden av utveckling eller av kroppens homeostas utan att påverka geners funktion under foster bedömning. För att säkerställa framgång för denna teknik, bör man vara medveten om fyra viktiga punkter: 1) st, 2) uttorkning av nålen, 3) minska volymen, och 4) minimal exponeringstid i sedering lösningen. Nålar som är för små kommer att täppa ofta, medan nålar som är för stora kommer att skada vent…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), vill vi tacka Ayele Tsedeke Taddese för teknisk support.
Materials
| Company | Catalog Number | Comments/Description | |
| Reagent/Material | |||
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information on www.genetools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information on www.genetools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricane (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSo4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Equipment | |||
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming / Brown needle puller | Sutter | More information on www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
Riferimenti
- Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6, 2011 (1998).
- Skromne, I., Prince, V. E. Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward. Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491, 114-118 (2012).
- Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. , (2013).
- Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. , (2012).
- Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. , (2011).
- Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).
- Madhavan, M., et al. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).
- Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. . Zebrafish: a practical approach. 261, 121-143 (2000).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don’t stop making antisense. Development. 135, 1735-1743 (2008).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Hyatt, T. M., Ekker, S. C. Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish. Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish. PLoS One. 4, (2009).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Liu, S., D, L. S. Zebrafish models for cancer. Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).
- Stoick-Cooper, C. L., et al. Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration. Development. 134, 479-489 (2007).
- Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins. BMC Dev. Biol. 13, (2013).
- McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice. Science. 241, 837-839 (1988).
- Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D’Eustachio, P., Mintz, B. Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos. Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).
