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Articolo metodologico

Sviluppo di amelogenina-chitosano Hydrogel per

14.6K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/51606

⸱

10 luglio 2014

 , 
1Center for Craniofacial Molecular Biology, Herman Ostrow School of Dentistry, University of Southern California

In questo articolo

Sommario

In questo articolo descriviamo un protocollo per la realizzazione di un idrogel amelogenin-chitosano per la ricostruzione superficiale dello smalto. Organizzato in crescita in situ di cristalli di apatite in idrogel formata una densa interfaccia smalto-restauro, che permetterà di migliorare l'efficacia e la durata dei restauri.

Abstract

La ricostruzione biomimetica dello smalto è un argomento significativo nella scienza dei materiali e nell'odontoiatria come nuovo approccio per il trattamento della carie dentale o dell'erosione. L'amelogenina ha dimostrato di essere una proteina fondamentale per il controllo della crescita organizzata dei cristalli di apatite. In questo articolo, presentiamo un protocollo dettagliato per la ricostruzione superficiale dello smalto utilizzando un nuovo idrogel di amelogenina-chitosano. Rispetto ad altri trattamenti convenzionali, come il fluoro topico e il collutorio, questo metodo non solo ha il potenziale per prevenire lo sviluppo della carie dentale, ma promuove anche un ripristino significativo e duraturo dello smalto. La microstruttura organizzata simile allo smalto regolata da assemblaggi di amelogenina può migliorare significativamente le proprietà meccaniche dello smalto mordenzato, mentre l'interfaccia densa smalto-restauro formata da una ricrescita in situ di cristalli di apatite può migliorare l'efficacia e la durata dei restauri. Inoltre, l'idrogel di chitosano è facile da usare e può sopprimere l'infezione batterica, che è il principale fattore di rischio per l'insorgenza della carie dentale. Pertanto, questo idrogel biocompatibile e biodegradabile di amelogenina-chitosano si mostra promettente come biomateriale per la prevenzione, il ripristino e il trattamento dello smalto difettoso.

Introduzione

Lo smalto dentale è la dura superficie mineralizzata dei denti umani. È composto da numerosi cristalli di apatite aghiformi, che sono raggruppati in prismi paralleli organizzati per garantire la resistenza meccanica unica e la protezione biologica che lo smalto fornisce1-2. A differenza di altri tessuti mineralizzati, come l'osso e la dentina, lo smalto maturo è acellulare e non può rigenerarsi dopo una sostanziale perdita di minerali1-2, che spesso si verifica come carie dentale o erosione. I prodotti disponibili in commercio come le vernici contenenti fluoro, i dentifrici e i collutori sono efficaci nel rimineralizzare lo smalto, ma nessuno di essi ha il potenziale per promuovere la formazione di cristalli di apatite organizzati. Dal punto di vista clinico, il trattamento convenzionale per la riparazione dello smalto prevede una procedura di riempimento con materiali artificiali come amalgama, ceramica o resina composita 3. Tuttavia, questi materiali di solito non si interfacciano bene con il tessuto naturale che circonda la lesione, perché le loro strutture, componenti e proprietà sono diverse dallo smalto naturale. Di conseguenza, la carie secondaria si sviluppa spesso nel tempo all'interfaccia tra il dente e i materiali estranei. Pertanto, la ricrescita in situ dello smalto con un'interfaccia densa è un obiettivo interessante per i campi della scienza dei materiali e della stomatologia. Un modo particolarmente promettente per raggiungere questo scopo è la sintesi biomimetica di materiale simile allo smalto sulla superficie dello smalto. Recentemente, sono stati fatti numerosi tentativi in vitro di preparare materiali simili allo smalto utilizzando sistemi biomimetici che contengono nano-apatiti o diversi additivi organici 4-12. Tuttavia, lo sviluppo della strategia biomimetica ottimale per promuovere la remineralizzazione dei cristalli per ottenere un'interfaccia densa perfetta è ancora una sfida.

Durante la mineralizzazione dello smalto, la crescita e l'allungamento orientati dei cristalli di apatite sono regolati da una matrice ricca di amelogenina 1,13-14. Per imitare la matrice organica nello sviluppo dello smalto, qui descriviamo un protocollo dettagliato per la fabbricazione di un idrogel di amelogenina-chitosano (CS-AMEL) per la ricrescita dello smalto in situ su una superficie di smalto mordenzata con acido utilizzata come modello per le lesioni erosive. Essendo "il terreno di coltura più versatile" per i cristalli 15, le matrici di idrogel hanno un vantaggio rispetto a un sistema in soluzione poiché clinicamente sono più facili da maneggiare. Inoltre, CS-AMEL è biocompatibile, biodegradabile e ha proprietà antimicrobiche e di adesione uniche che si confrontano favorevolmente con altri sistemi biomimetici per applicazioni dentali 16. È importante sottolineare che la mineralizzazione in situ dei cristalli di apatite sulla superficie dello smalto fornisce un'interfaccia densa tra lo strato riparato e lo smalto naturale, che può potenzialmente migliorare la durata dei restauri e prevenire la formazione di nuove carie ai margini del restauro.

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Protocollo

I molari umani sono stati estratti seguendo le procedure standard per l'estrazione presso la Scuola Ostrow di Odontoiatria della University of Southern California e trattati con l'approvazione del Comitato Istituzionale.

1. Preparazione del dente acidato Slice

  1. Selezionare un terzo molare umano, senza carie restaurati.
  2. Rimuovere la porzione di radice del molare, e tagliare la corona del molare longitudinalmente in fette 2 mm di spessore con un basso numero di giri disco diamantato raffreddato ad acqua. Pulire con ultrasuoni queste fette per 2 minuti e poi sciacquare con acqua deionizzata per 3 volte.
  3. Per simulare lesioni erosive, incidere le fette di dente con acido fosforico al 30% per 30 sec poi sciacquare immediatamente con acqua deionizzata.
  4. Ultrasuoni pulire le fette incise per 2 minuti e poi sciacquare con acqua deionizzata per 3 volte.

2. Preparazione di Amelogenina-chitosano Hydrogel

  1. Preparation di chitosano soluzione madre
    1. Sciogliere 1% (w / v) chitosano (peso molecolare medio, 75-85% deacetilato) in una (v / v) soluzione di acido acetico 1% seguita da agitazione a 80 ° CO / N.
    2. Dopo raffreddamento la soluzione a RT, filtrare la soluzione di chitosano con un filtro da 0,45 micron. Regolare il pH a 5,0 con l'aggiunta di soluzione 1 M NaOH.
  2. Preparazione di calcio e fosfato soluzione madre (0.1 M)
    1. Pesare cloruro di calcio (CaCl 2) e preparare una soluzione 0.1 M, quindi mescolare con un vortice fino a quando la soluzione è limpida. Regolare il pH a 11 con l'aggiunta di soluzione 1 M NaOH.
    2. Pesare sodio fosfato bibasico (Na 2 HPO 4) e preparare una soluzione 0.1 M, quindi mescolare con un vortice fino a quando la soluzione è limpida.
  3. Espressione e purificazione di amelogenin ricombinante 17-18
    L'intera lunghezza amelogenin suina ricombinante (rP172) qui utilizzato ha 172 aminoacidi ed è un analogo della pienaLunghezza porcine P173 nativo, ma manca la metionina N-terminale e un gruppo fosfato sulla Ser16 18.
    1. Aggiungere 20 g di lisogenia brodo (LB) Agar polvere in 500 ml di acqua deionizzata, la soluzione in autoclave a 121 ° C (impostazione di liquido) per 20 min. Lasciate raffreddare agar a ~ 55 ° C, aggiungere ampicillina (100 pg / ml) in soluzione di agar.
    2. Trasferire la soluzione di agar per piastre di Petri, lasciare che ogni piastra fredda finché è solido, quindi capovolgere per evitare la condensa sulla agar. Piastre Conservare in sacchetti di plastica a 4 ° C.
    3. Streak piastra di agar LB con cellule ricombinanti (E.coli-BC21) dal glicerolo magazzino (-80 ° C). Incubare le piastre O / N a 37 ° C.
    4. Preparare 50 ml di media NZCYM e autoclave mezzi di comunicazione a 121 ° C per 30 min. Lasciare i media a raffreddare, aggiungere 50 ml di 100 pg / ml ampicillina alle 50 ml media.
    5. Inoculare una singola colonia dalla piastra di agar LB in media 50ml NZCYM supplementato con ampicilltrovi Incubare le cellule O / N in un incubatore agitazione a 37 ° C.
    6. Preparare 1 L di supporti NZCYM autoclave e il supporto a 121 ° C per 30 min. Aggiungere 1 ml di 100 mg / ml di ampicillina a 1.000 ml media. Prendere una densità ottica di lettura (OD) come bianco, utilizzando un UV-Vis. NOTA: Non smaltire questo dopo la prima lettura.
    7. Inoculare 10 ml di coltura cellulare dal punto 2.3.5 in 1.000 ml supporti dal punto 2.3.6. Leggere la densità ottica a 595 nm immediatamente dopo l'inoculazione. Prendere la lettura di densità ottica per tenere traccia della crescita. NOTA: Leggere il vuoto ogni volta che l'OD è presa.
    8. Indurre con 700 ml di isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG, 1 M) quando la crescita batterica raggiunge a circa 0,75 ~ 0,8 OD a 595 nm.
    9. Raccogliere le cellule quando il diametro raggiunge 1.1. Versare il contenuto del matraccio in 6 bottiglie di plastica. Equilibrio e pesare le bottiglie prima di utilizzare la centrifuga. Centrifugare per 20 min a 8554 xg a 4 ° C.Mantenere il pellet di cellule nel -20 ° CO / N.
    10. Estrarre i pellet cellulari e combinarli in un tubo da 50 ml. Aggiungere 3,5 ml di HCl 4M Guanidina per L di fermentazione. Tempi ultrasuoni 2-3 su ghiaccio, 30 sec ogni volta, con intervalli di 1 min.
    11. Effettuare diluizioni 6x di volume delle cellule con 0,5% di acido formico e lasciare mescolare nella stanza fredda per 2 ore. Centrifugare per 30 min, 8554 xga 4 ° C. Conservare il surnatante. Aggiungi il 20% di solfato di ammonio satura utilizzando la soluzione magazzino saturi e scalpore nella stanza fredda, O / N.
    12. Centrifugare per 30 min, 8.554 xg a 4 ° C e mantenere il pellet. Ricostituire il pellet in 0,1% di acido trifluoroacetico (TFA), carico su una colonna C4 (10 x 250 mm, 5 micron), e frazionare usando un gradiente lineare di A = 0,1% TFA e B = 60% acetonitrile in TFA, in un portata di 1,5 ml · min -1.
    13. Congelare la soluzione proteica in ghiaccio secco e liofilizzare il campione congelato O / N.
  4. Preparazione di amelogenina-chitosano (CS-AMEL) HYDROGel (Figura 1A)
    1. Aggiungere 200 mg di rp172 in una provetta contenente 960 ml di soluzione di chitosano 1%, quindi mescolare con un vortice fino a quando la soluzione è limpida.
    2. Aggiungere 25 ml di 0,1 M CaCl 2 soluzione seguiti da 15 ml di 0,1 M Na 2 HPO 4 soluzione alla soluzione di chitosano-amelogenina contenente, poi miscelare con un vortex per 5 min.
    3. Aggiustare il pH della soluzione di CS-AMEL a 6,5 ​​aggiungendo con precauzione soluzione 1 M NaOH. CS-AMEL idrogel si forma quando il pH raggiunge 6,5.

3. Smalto ricrescita in Amelogenina-chitosano Hydrogel

  1. Preparazione della soluzione di saliva artificiale
    1. Sciogliere una certa quantità di cloruro di magnesio (MgCl2, 0,2 mM), cloruro di calcio (CaCl 2, 1 mM), potassio diidrogeno fosfato (KH 2 PO 4, 4 mM), cloruro di potassio (KCl, 16 mM) e cloruro di ammonio ( NH 4 Cl, 4,5 mm) in 20 mM HEPES(4 - (2-idrossietil) piperazina-1-etano-solfonico) tampone 12.
    2. Aggiustare il pH a 7,0 con 1 M NaOH e conservare la soluzione di saliva artificiale a 4 ° C.
    3. Prima di utilizzare la soluzione, aggiungere fluoruro di sodio (NaF, 300 ppm).
  2. Applicazione del CS-AMEL idrogel
    1. Applicare circa 20 microlitri CS-AMEL idrogel alla fetta dente incise usando una siringa (Figura 1B).
    2. Asciugare la fetta dente idrogel coperto in un essiccatore a temperatura ambiente per 2 ore.
    3. Trasferire la fetta dente in un becher contenente 30 ml di soluzione di saliva artificiale. Coprire il becher con foglio di alluminio, e quindi mantenere il becher in stufa a 37 ° C per 7 giorni.
    4. Rimuovere la fetta dente e asciugarlo in un essiccatore a temperatura ambiente.

4. Caratterizzazione di interfaccia tra il livello di nuova produzione e smalto

La microstruttura dell'interfaccia tra lo strato appena cresciuti e smalto era osserato il microscopio elettronico a scansione (SEM) e alta rivoluzione microscopia elettronica a trasmissione (HR-TEM). Il campione TEM è stato preparato usando un fascio ionico focalizzato (FIB) tecnica, i passaggi per i quali sono come segue.

  1. Caricare il campione in uno strumento FIB-SEM e finire tutti gli allineamenti secondo le istruzioni per l'uso. NOTA: La regolazione fine Z dovrebbe essere effettuata almeno 2 volte.
  2. Depositare uno strato di carbonio (15 × 3 micron) sul campione per proteggere la struttura sottostante (Figura 2A).
  3. Mill il campione attentamente i lati superiore, inferiore e destro strato di carbone per preparare un sottile pezzo di campione, e poi tagliare il lato inferiore di questo pezzo sottile. NOTA: Controllare l'allineamento del fascio Ion prima di ogni passo di fresatura (Figura 2B).
  4. Saldare una punta Pt sul pezzo sottile e tagliare il lato sinistro per separare il pezzo campione (Figura 3C). NOTA: Controllare l'allineamento fascio di ioni prima della fase di saldatura.
  5. Sollevare tegli pt punta con il campione lentamente, e montare il campione lamellare su una griglia TEM lift-out.
  6. Staccare la punta dal campione, e sottile il campione fino a quando il suo spessore è inferiore a 100 nm (Figura 3D). Togliere il campione dal strumento per eseguire l'osservazione TEM. NOTA: Controllare l'allineamento del fascio Ion prima di ogni processo di assottigliamento.

5. Valutazione delle proprietà di legame e meccaniche del livello di nuova produzione

  1. La forza di legame è valutata mediante trattamento ultrasonico. Mantenere la fetta dente riparato in ultrasuoni (42 kHz, 100 W) per 10 minuti, e poi osservare l'interfaccia tra lo strato riparato e smalto naturale con elettroni retrodiffusi analisi SEM.
  2. Misurare la durezza e il modulo elastico a 20 punti di prova di ciascun superficie dello smalto riparato (n = 3) da un nano-penetratore con una punta Berkovich.

6. Immunofluorescenza

  1. Lavare la fetta dente con Tris buffer salino (TBS) per 15 min.
  2. Bloccare con 1% di siero albumina bovina (BSA) in TBS per 15 min.
  3. Rimuovere il liquido e incubare il campione O / N con 1 ° Ab (1:500 pollo Anti-Amelogenina) diluiti in TBS (0,1% BSA, 0,3% Triton X-100).
  4. Lavare il campione con TBS per 30 min e incubare O / N con 2 ° Ab (1:100 FITC anti-pollo) diluiti in TBS.
  5. Lavare il campione con TBS per 30 minuti e lasciare asciugare per altri 30 min.
  6. Osservate al microscopio a fluorescenza.

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Risultati

L'efficacia del protocollo qui descritto è dimostrato dalla microscopia elettronica a scansione (SEM), regione selezionata diffrazione elettronica (SAED) e diffrazione di raggi X (XRD) analisi. Dopo la riparazione da amelogenin-chitosano (CS-AMEL) idrogel per 7 giorni, uno strato simile allo smalto con uno spessore di 15 um era formato sulla superficie dello smalto incisa. Lo strato appena cresciuto era fatto di matrici altamente ordinato di cristalli con un diametro di circa 50 nm, cresce preferenzialmente lungo l&...

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Discussione

Mentre il contenuto minerale di smalto è elevato rendendo più difficile il tessuto mineralizzato nel corpo umano, questa bioceramica è suscettibile di processi di demineralizzazione, che spesso si verificano come carie o erosione. Mutazioni genetiche possono anche causare lo smalto sottili o morbidi che portano a una serie di malattie ereditarie di smalto malformazione chiamata Amelogenesi Imperfetta 20. Prodotti per la salute orale contenenti fluoruro o CPP-ACP sono stati sul mercato per diversi ann...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare il Prof. Steven Nutt e il Sig. Yuzheng Zhang per l'assistenza con il Focus Ion Beam, e il Center for Electron Microscopy and Microanalysis (CEMMA) presso USC per la microscopia elettronica. La ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIH-NIDCR; DE-13414 e DE-020099 a J.M.O.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Terzo molare umano Ostrow School of Dentistry della University of Southern California.N/AI molari umani sono stati estratti seguendo le procedure standard per l'estrazione presso la Ostrow School of Dentistry della University of Southern California e gestiti con l'approvazione dell'Institutional Review Board.
Espressione e purificazionedell'amelogenina pocina ricombinanteN/ArP172, a lunghezza intera.
Chitosano Sigma-Aldrich448877deacetilato a medio peso molecolare, 75-85%
VWRAA033266
Acido acetico glacialeVWRA036289
Idrossido di sodioVWRBDH9292
Cloruro di calcioSigma-Aldrich223506
Fosfato di sodio bibasico anidroVWRBDH0316
BL21-CodonPlus (DE3)-RP Tecnologie Agilent Inc.
Solfato di ammonioVWRBDH8001
Acido trifluoroaceticoVWRAAAL06374
AcetonitrileVWRBDH1103
Cloruro di magnesio...VWRBDH0244
Potassio diidrogeno fosfato VWRBDH9268
Cloruro di potassio VWRBDH0258
Cloruro di ammonio VWRAAAA15000
HEPES (acido 4-(2-idrossietil)piperazina-1-etano-solfonico)VWRAAA14777
Fluoruro di sodio VWRAA11561
soluzione salina tamponata con TrisBio-Rad170-643510&volte; TBS
Albumina sierica bovinaEMD Millipore 12659CalBioChem, albumina, siero bovino, frazione V, metalli pesanti bassi 
Triton X-100EMD Millipore TX1568-1
Pollo Anti-AmelogeninaN/AN/AUn regalo dal Prof. Malcolm Snead, University of Southern
California Bovino Anti-Pollo IgY-FITCSanta Cruz BiotechnologySc-2700
Sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioniAgilent Technologies Inc.Varian Prostar 210
C4 colonnaPhenomenx Jupiter 5μ 300A
Microscopia elettronica a scansione JEOL JSM-7001
FIB-SEM JEOL JIB-4500
Microscopia elettronica a trasmissione JEOLJEM-2100F
Sega diamantata digitale a bassa velocitàMTI CorporationSYJ-150
Microscopia a fluorescenzaLeicaDMI3000 B
Pulitore ad ultrasuoni...Branson 251042 kHz, 100 W
Nano-penetratore Tecnologie Agilent Inc.MTS XP
in laboratorio Acido fosforico 230255

Riferimenti

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