EPR פיקוח חיזור טיטרציה של הקו-הפקטורים של<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Nar1
Summary
The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.
Abstract
אלקטרונים פאראמגנטיים תהודה (EPR) במעקב titrations חיזור הוא שיטה רבת עוצמה כדי לקבוע את פוטנציאל נקודת האמצע של קו-פקטורים בחלבונים ולזהות ולכמת את הקו-הפקטורים במדינת חיזור לזיהוי.
הטכניקה היא משלימה לאלקטרוכימיה הישירה (voltammetry) מתקרבת, כפי שהוא אינו מציע מידע על קצב העברת אלקטרון, אבל אין להקים את מדינת הזהות וחיזור של הקו-הפקטורים בחלבון הנחקר. הטכניקה היא נרחב החלים על כל חלבון המכיל קו-פקטור תהודה מגנטי אלקטרונית (EPR) לזיהוי.
טיטרציה טיפוסית דורשת 2 מיליליטר חלבון עם ריכוז קו-פקטור בטווח של 1-100 מיקרומטר. החלבון הוא טיטרציה עם reductant כימי (dithionite נתרן) או חמצון (ferricyanide אשלגן) על מנת לשמור על שווי משקל המדגם בפוטנציאל מסוים. חוט פלטינה ואלקטרודה התייחסות Ag / AgCl מחוברים לוולטמטר כדי למדוד את הפוטנציאל של פתרון החלבון. סט של 13 מתווכי חיזור שונים משמש לאזן בין הקו-פקטורי חיזור של החלבון ואת האלקטרודות. מדגם הוצא בפוטנציאלים שונים וספקטרום אלקטרונים פאראמגנטיים תהודה, אופייניים לקו-פקטורי חיזור השונים בחלבון, נמדדים. העלילה של עוצמת האות לעומת פוטנציאל המדגם מנותחת באמצעות משוואת נרנסט על מנת לקבוע את פוטנציאל נקודת האמצע של הקו-הפקטור.
Introduction
מה שמדהים הוא התהליכים הכימיים הבסיסיים ביותר לקיום חיים על פני כדור הארץ, פוטוסינתזה, קיבעון ונשימה חנקן זה, הם זרזו ידי קומפלקסי חלבונים גדולים המכילים מגוון רחב של קו-פקטורי חיזור אורגניים ואי-אורגני. הערכה הוא כי כ -30% מכלל החלבונים מכילים קו-פקטורי מתכת אחד או יותר. 1,2 זיהוי ואפיון ניתן להקים הקו-פקטורי חיזור באמצעות אלקטרוכימיה הישירה (למשל, voltammetry סרט חלבון) או titrations חיזור. שתי הטכניקות הן משלימה בטבע ותחולתם. Voltammetry מציע נחישות מהירה של פוטנציאלי אמצע וקינטיקה העברת אלקטרונים של קו-פקטורים שיכולים להגיב עם משטח אלקטרודה. 3,4 בדרך כלל זה עובד היטב עבור חלבוני העברת אלקטרונים, כגון ציטוכרום C או ferredoxin. וזה לפעמים עובד לחלבונים מורכבים יותר, כי כבר משותקים למשטח אלקטרודה. ידע מפורט שלטבעו של קו-פקטורים בחלבון צריך להיות זמין, כvoltammogram לא נותן שום מידע ישיר על זהותו של הקו-הפקטור. titrations חיזור יותר מייגע לבצע ודורש כמויות מ"ג של חלבון. עם זאת, הם מציעים מידע על פוטנציאל נקודת האמצע ואת זהותו של הקו-הפקטור. 5 כמו כן בטיטרציה אחד יכול להיות במעקב קו-פקטורים מרובים בחלבון.
העיקרון של טיטרציה חיזור הוא שהחלבון הפעיל חיזור או האנזים מופחת או חמצון כימי. על מנת לוודא כי הקו-הפקטורים להגיב עם מתווכי חיזור reductant או חמצון משמשים. מתווכי חיזור אלה גם להגיב עם אלקטרודה, כך שהפוטנציאל של הפתרון ניתן למדוד. המתווכים לחצוץ חיזור ולאזן בין הקו-הפקטורים בחלבון ואת האלקטרודה. לאחר כימי poising הפוטנציאל לערך הרצוי, מדגם נמשך ובמהירות קפואה בחנקן נוזלי לAWAIT ניתוח נוסף עם טכניקות ספקטרוסקופיות. ספקטרוסקופיה EPR היא שימושית במיוחד בהקשר זה כפי שהוא יכול לשמש למדידת כמותית מרכזי מתכת פאראמגנטיים או רדיקלים אורגניים.
טיטרציה חיזור יכולה להתבצע בשני כיוונים: מגבוה לנמוכה או גבוה מפוטנציאל של נקודת אמצע נמוך. הבחירה תלויה ביציבות של הקו-הפקטורים במחקר. לעתים קרובות זה חכם להתחיל בפוטנציאל נמוך ולהוסיף חמצון לשלבים להגדיל את הפוטנציאל. זה נקרא טיטרציה חמצוני, והוא מתואר כאן. כאן אנו מראים טיטרציה חיזור של אשכול ברזל-גופרית המכיל חלבון Nar1 מSaccharomyces cerevisiae. חלבון זה מעורב, ככל הנראה כחלבון פיגום, במכונות biosynthetic אשכול ברזל-גופרית cytosolic (מסלול CIA). 6,7
Protocol
Representative Results
Discussion
הסדרה של 13 מתווכי חיזור מאפשרת שיווי משקל חיזור בפתרון בטווח של -.45 ל0.3 V לעומת SHE (טבלה 1 ואיור 3). ובכן מעל ומתחת פוטנציאלים אלה כל המתווכים הם גם צמצמו לחלוטין או מתחמצנים לחלוטין ולכן אין איזון נוסף עם המרכזים הפעילים חיזור של החלבון יכול להתרחש. זה רעיון חשוב…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי מענק מחקר מהשילוב הלאומי בית ספר מחקר ההולנדי, קטליזה בשליטה כימית עיצוב (NRSC-קטליזה). ד"ר HY Steensma וד"ר GPH ואן Heusden מאוניברסיטת ליידן, מקבלים הכרה על תמיכתם בביטוי רקומביננטי של ס ' cerevisiae Nar1.
Materials
| Reference electrode (Ag/AgCl) | Radiometer | ||
| Chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| EPR spectrometer | Bruker | ||
| N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylendediamine (TMPD) ·(HCl)2 | 637-01-4 | ||
| 2,6-dichlorophenol indophenol (DCIP), sodium salt | 620-45-1 | ||
| Phenazine ethosulfate (PES) | 10510-77-7 | ||
| Methylene blue | 122965-43-9 | ||
| Resorufin, sodium salt | 34994-50-8 | ||
| Indigodisulfonate (indigo carmine) | 860-22-0 | ||
| 2-hydroxy-1,4-naphtaquinone | 83-72-7 | ||
| Anthraquinone-2-sulfonate Na+ H2O | 153277-35-1 | ||
| Phenosafranin | 81-93-6 | ||
| Safranin O | 477-73-6 | ||
| Neutral red | 553-24-2 | ||
| Benzyl viologen | 1102-19-8 | ||
| Methyl viologen | 1910-42-5 |
Riferimenti
- Lippard, S. J., Berg, J. M. . Principles of Bioinorganic Chemistry. , (1994).
- Bertini, I. . Bioinorganic Chemistry. , 611 (1994).
- Leger, C., et al. Enzyme Electrokinetics: Using Protein Film Voltammetry To Investigate Redox Enzymes and Their Mechanisms. Biochimica. 42, 8653-8662 (2003).
- Hagen, W. R. Direct Electron Transfer of Redox Proteins at the Bare Glassy Carbon Electrode. Eur. J. Biochem. 182, 523-530 (1989).
- Pierik, A. J., et al. Redox Properties of the Iron-Sulfur Clusters in Activated Fe-Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough). Eur. J. Biochem. 209, 63-72 (1992).
- Balk, J., Pierik, A. J., Netz, D. J., Muhlenhoff, U., Lill, R. The Hydrogenase-like Nar1p is Essential for Maturation of Cytosolic and Nuclear Iron-Sulphur Proteins. EMBO J. 23, 2105-2115 (2004).
- Sharma, A. K., Pallesen, L. J., Spang, R. J., Walden, W. E. Cytosolic Iron-Sulfur Cluster Assembly (CIA) System: Factors, Mechanism, and Relevance to Cellular Iron Regulation. J. Biol. Chem. 285, 26745-26751 (2010).
- Aasa, R., Vänngård, T. EPR Signal Intensity and Powder Shapes. A Reexamination. J. Magn. Reson. 19, 308-315 (1975).
- Balk, J., Pierik, A. J. A., Netz, ., J, D., Mühlenhoff, U., Lill, R. Nar1p, a conserved eukaryotic protein with similarity to Fe-only hydrogenases, functions in cytosolic iron-sulphur protein biogenesis. Biochem. Soc. Trans. 33, 86-89 (2005).
- Hennessy, D. J., Reid, G. R., Smith, F. E., Thompson, S. L. Ferene – a new spectrophotometric reagent for iron. Can. J. Chem. 62, 721-724 (1984).
- Flint, D. H., Emptage, M. H., Guest, J. R. Fumarase A from Escherichia coli: purification and characterization as an iron-sulfur cluster containing enzyme. Biochimica. 31, 10331-10337 (1992).
- Hagedoorn, P. L., Driessen, M. C., Mvd Bosch, ., Landa, I., Hagen, W. R. Hyperthermophilic Redox Chemistry: a Re-evaluation. FEBS Lett. 440, 311-314 (1998).
- Tadesse, M. A., D’Annibale, A., Galli, C., Gentili, P., Sergi, F. An assessment of the relative contributions of redox and steric issues to laccase specificity towards putative substrates. Organic & biomolecular chemistry. 6, 868-878 (2008).
