T 세포 반응의 평가를위한 형광 대상 배열의 사용<em> 생체 내</em
Summary
생체 내에서 상세히 T 세포 반응을 모니터링 할 수있는 능력은 면역 반응에 대한 이해의 발전을 위해 중요하다. 여기에서 우리는 유동 세포 계측법에 의해 동시에> 250 매개 변수를 평가하는 생체 내 T 세포의 분석에서 형광 타겟 어레이 (FTA 체결)의 사용을 설명한다.
Abstract
생체 내에서 T 세포 반응을 모니터링 할 수있는 능력은 면역 반응에 대한 이해의 개발 및 면역 요법의 설계에 중요하다. 과 적색 레이저 흥분 염료 (셀 확산 염료 eFluor 670 : 여기 우리는 카르복시 숙신 에스테르 (CFSE), 바이올렛 레이저 흥분 염료 (CTV CellTrace 바이올렛)과 같은 중요한 염료를 활용 형광 대상 배열 (FTA) 기술의 사용을 설명 CPD )> 250 뚜렷한 형광 세포 클러스터로 레이블 마우스 림프구 된 조합입니다. 이러한 자유 무역 협정 내에서 세포 클러스터는 주요 조직 적합성 (MHC) 클래스-I과 MHC 클래스 II 바인딩 펩타이드와 펄스함으로써 각각 CD8 +와 CD4 + T 세포에 대한 표적 세포의 역할을 할 수있다. 이러한 FTA 세포는 실행 가능하고 완전한 기능을 유지하며, 따라서 FTA 대상 세포와 CD4 + T 세포 묵상 헬의 CD8 + T 세포 – 매개 살인의 평가를 할 수 있도록 마우스로 관리 할 수 있습니다유동 세포 계측법에 의해 생체 내에서 실시간으로 FTA B 세포 표적 세포의 P. > 250 표적 세포가 동시에 평가 될 수 있기 때문에, 기술은 여러 가지 농도의 복수 복제물 여러 항원 에피토프 대한 T 세포 반응의 모니터링을 허용한다. 이와 같이, 기술은 정량적 (반응의 예 누적 크기) 및 정 성적 (예. 기능적 결합력 및 응답의 에피토프 – 교차 반응성) 수준 모두에서 T 세포 반응을 측정 할 수있다. 여기서, 우리는 이들의 FTA가 생성 그들은 재조합 수두 바이러스 백신에 의해 유도 된 T 세포 반응을 평가하기 위해 적용 할 수있는 방법의 예를 제공하는 방법을 설명한다.
Introduction
T 세포는 적응성 면역 반응에서 중심적인 역할을하고 종종 면역 요법의 조작 대상이된다. CD4 + 이펙터 T 세포는 면역의 여러 측면을 조절하고 직접 항체를 생산하는 B 세포를 도울 수 사이토 카인을 분비하여 외부 항원에 반응한다. CD8 + 세포 독성 T 세포 (CTL을)도 사이토 카인을 분비뿐만 아니라 직접 외국 항원을 발현하는 세포를 죽이는의 중심 역할을하여 외부 항원에 응답 할 수 있습니다. 이러한 T 세포의 효과기 기능을 개시 기본적인 상호 작용은 세포의 표면에서 MHC 분자에 표시 외래 펩티드와 T 세포 수용체 (TCR)의 상호 작용을 수반한다. CD4 + T 세포는 일반적으로 미생물에 감염된 세포에 표시되는 MHC 클래스-I 분자에 표시된 펩티드를 인식하는 항원 제시 세포 및 CD8 + T 세포의 MHC 클래스 II 분자에 표시된 펩티드를 인식한다.
순서대로T 세포는 면역 반응에서 재생 역할을 평가하기 위해, 그들의 이펙터 기능은 신뢰성과 민감한 기술에 의해 측정하는 것이 필수적이다. T 세포 반응 평가를위한 일반적인 방법은 다음과 같습니다; MHC class-I/II/peptide 사량의 반응; ELISPOT 및 세포 내 사이토 카인 염색에 의한 사이토 카인 생성; 51 크롬 출시 분석하여 용량을 죽이는. 이러한 분석은, 그러나, 일반적으로 시험관 내 자극 생체를 수행하거나, T 세포 기능에 한정 통찰력을 제공한다. T 세포 반응을 측정 할 때 시험 관내 자극을 통해 발생할 수있는 기능적인 파라미터 변화를 피하기 위하여 그들이 T 세포에 대한 조작에 따라 발생하는 이상적으로는 생체 내에서, 원위치에서 그들을 평가하는 것이 유익 할 것이다. 가장 일반적으로 생체 내 T 세포 기능 분석에 사용 된 일부는 생체에 열거되어 MHC 클래스 I 결합 펩티드로 펄스 표적 세포의 CTL 매개 살해를 측정에 기초같은 CFSE 같은 중요한 염료와 형광 표지를 통해 자신의 감지를 통해. 이들은 생체 내에서 일어날 때 분석법 이러한 유형의 표적 CTL 매개 살해를 모니터링 할 수 있지만, 이들은 이전 정성 파라미터는 허용하도록 요구되는 다른 농도와 펩타이드 에피토프의 다른 유형을 제시하는 복수의 타겟의 살해를 평가하는 비교적 제한된 용량 있었다 같은 기능 갈망과 에피토프 변형 교차 반응을 평가한다. 이 분석은 또한 CD4 + T 세포 매개 반응에 대한 정보를 제공하지 않습니다.
우리가 최근에 의해 동물에서 일제히> 250 표적 세포에 대한 T 세포 반응의 모니터링을 허용 형광 타겟 어레이 (의 FTA)에 기초하여 다중 분석법을 개발, T 세포 반응을 평가하기 위해 사용되는 현재의 방법에 많은 한계를 극복하기 위해 1, 2, 유동 세포 계측법. 자유 무역 협정은 SEV으로 표시 림프구로 구성되어 있습니다독특한 형광> 250 셀 클러스터가 생성 될 수 있도록 CFSE, CTV 및 CPD 같은 중요한 염료 ERAL 농도 및 이들의 조합. 이러한 세포가 생존하고 완전한 기능을 유지하기 때문에, 이들은 생체 소재 효과기 T 세포와의 상호 작용의 모니터링을 허용하는 동물에 주입 될 수있다. 예를 들어, FTA 셀 클러스터는 표적 세포의 한 항원 특이 CTL 매개 살해의 평가를 허용하는 MHC 클래스-I 결합 펩티드로 펄스 화 될 수있다. 또한, FTA 세포 클러스터는 허용, MHC 클래스-II 결합 펩타이드와 펄스 수있는 항원 특정 T 헬퍼 세포와 같은 CD69, CD44 및 / 또는 활성 마커의 평가에 의해 (활성을 평가하여 (T H) 활동의 평가 동족 펩타이드 2 베어링 FTA 내에서 B 세포의 CD62L). 250 개 이상의 타겟을 동시에 검출 할 수 있기 때문에, N으로 펄싱 많은 타겟 셀 클러스터에 대해 CTL 및 T H 응답을 측정 할 수있다상이한 농도의 많은 반복 실험의 포함에 umerous 펩타이드. FTA 분석은 따라서 생체 내에서 T 세포 이펙터 반응 평가의 전례없는 수준을 제공합니다.
여기서는 상세히 FTA의 구성을 설명하고 그들이 생체 내 T 세포 반응을 평가에 적용 할 수있는 방법을 보여준다. 절차는 MHC 클래스-I 및 II-결합 펩티드와 펄싱 42 셀 클러스터 6 반복으로 구성된 세 개의 중요한 염료의 사용을 통해 (252) 뚜렷한 세포 클러스터로 구성 FTA의 구성을 설명한다. 라벨의 양을 줄임으로써 필요한 42 셀 클러스터의 라벨이 튜브 바닥 10 ㎖ 원추형 발생하고, 표 1에 나타낸 바와 같이 튜브 랙에 이러한 레이아웃에 도움이된다.이 방법은 식별 가능한 클러스터의 작은 숫자 조정될 수있다 각 염료 1을 수행 하였다.
우리는 응 답을 측정 할 수있는 방법을 표시하여 분석의 유용성을 강조생쥐의 작은 일대에 여러 항원에 대한 재조합 수두 바이러스 예방 접종에 의해 생성 된 에스. 이것은 FTA 분석은, 각각을 통해 곡선 (AUC) 평가 및 반 최대 응답 (EC 50)을 생성하는 데 필요한 효과적인 펩타이드 농도 측정 용 영역의 사용을 누적 반응과 기능적 결합력을 측정하기 위하여 이용 될 수 있는지 보여준다.
Protocol
Representative Results
Discussion
FTA 기반 분석의 장점은 유동 세포 계측법에 의해 하나의 호스트 동물에서> (250) 실행 가능하고 완전한 기능을 대상 세포 집단의 차별을 허용하는 것입니다. 이는 이전에 불가능했습니다 생체 유동 세포 계측법 기반 분석의 복잡성의 수준을 제공합니다. 이 6 농도에서 7 별개의 바이러스 항원에 대한 반응 등 AUC와 EC 50과 같은 매개 변수가 생체 내에서 T 세포 반응에 대해 결?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 프로젝트 보조금 # 1010395 (BQ와 CP) 및 # 525431 (CR), 호주, 간염 및 HIV 바이러스학 EOI를 위해 호주 센터의 국립 보건 의학 연구위원회에서 프로그램 부여 # 455395 (CP)에 의해 지원되었다 2012 그랜트 (CR 및 RJJ)와 고든과 그레텔 목동 재단 (BQ와 CR)에서 부여. 우리는 JCSMR FACS 실험실의 그들의 우수한 유지 보수를 위해 Harpreet VOHRA 마이클 Devoy을 감사드립니다, 펩타이드 합성 호주 암 연구 재단 생명 자원 시설, JCSMR, ANU, 박사 데이비드 보일, CSIRO 동물 건강 연구소, 질롱, 호주 부모 HIV 백신의 주식을 제공.
Materials
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Fetal calf serum | Serana | FCS-500 | |
| CTV | Invitrogen | C34557 | |
| CFDA, SE | Invitrogen | C1157 | |
| CPD | eBioscience | 65-0840-90 | |
| anti-B220 PerCp-Cy5.5 | eBioscience | 110730 | |
| anti-CD69 brilliant violet 605 | Biolegend | 104529 | |
| PKH-26 | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| EQUIPMENT: | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Vortex | Scientific Industries Inc | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) | BD Bioscience |
Riferimenti
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