La capacità di monitorare le risposte delle cellule T in dettaglio in vivo è importante per lo sviluppo della nostra comprensione della risposta immunitaria. Qui si descrive l'uso di array di destinazione fluorescenti (ALS) in un test in vivo di cellule T in che valuta> 250 parametri contemporaneamente mediante citometria a flusso.
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Articolo metodologico
L'uso di fluorescenti target matrici per la valutazione delle cellule T risposte
In questo articolo
Sommario
Abstract
La capacità di monitorare le risposte delle cellule T in vivo è importante per lo sviluppo della nostra comprensione della risposta immunitaria e la progettazione di immunoterapie. Qui si descrive l'uso della tecnologia matrice di destinazione fluorescente (FTA), che utilizza coloranti vitali come ester carbossifluoresceina succinimidyl (CFSE), laser viola coloranti eccitabili (CellTrace Violet: CTV) e laser rosso coloranti eccitabili (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD ) per combinatorialmente linfociti del mouse etichette in> 250 distinguibili gruppi di cellule fluorescenti. Gruppi di cellule all'interno di questi ALS possono essere pulsate con maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I e MHC classe II-peptidi leganti e quindi agiscono come cellule bersaglio per CD8 + e CD4 +, rispettivamente. Queste cellule FTA rimangono vitali e pienamente funzionale, e possono quindi essere somministrati in topi per consentire la valutazione della CD8 + T uccisione cellulo-mediata delle cellule bersaglio FTA e CD4 + T hel cell-meditatap delle cellule bersaglio cellule FTA B in tempo reale in vivo mediante citometria a flusso. Da> 250 cellule bersaglio possono essere valutati in una volta, la tecnica consente di monitorare risposte delle cellule T contro diversi epitopi antigenici in diverse concentrazioni e in più replicati. Come tale, la tecnica può misurare le risposte delle cellule T sia un quantitativo (ad esempio la grandezza cumulativo della risposta) e qualitativa (ad es. Avidità funzionale e epitopo-cross reattività della risposta) livello. Qui, descriviamo come tali ALS sono costruiti e danno un esempio di come possono essere applicati per valutare le risposte delle cellule T indotta da un vaccino pox virus ricombinante.
Introduzione
Cellule T svolgono un ruolo centrale nella risposta immunitaria adattativa e sono spesso mirati per la manipolazione in immunoterapia. Cellule T effettrici CD4 + rispondono ai antigene estraneo secernendo citochine che regolano molti aspetti di immunità e può anche aiutare direttamente le cellule B a produrre anticorpi. Cellule CD8 + T citotossici (CTL) possono anche rispondere alle antigene estraneo secernendo citochine, così come un ruolo centrale nella uccidere direttamente le cellule che esprimono un antigene estraneo. L'interazione fondamentale che avvia queste funzioni effettrici delle cellule T comporta l'interazione del recettore....
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Protocollo
Nota: I topi utilizzati ai sensi del presente protocollo sono state gestite secondo le linee guida della Australian National University Sperimentazione animale Comitato Etico e topi sono stati sacrificati per dislocazione cervicale.
1. Dye e Peptide Preparazione
- Preparazione Dye
Nota: I coloranti sono prediluiti a diverse concentrazioni per permettere l'etichettatura delle cellule a intensità di fluorescenza discreti. CFSE viene utilizzato a sette concentrazioni effettuate attraverso diluizioni seriali 3.5-fold, e CTV e CPD sono utilizzati in sei diverse concentrazioni effettuate attraverso diluizioni seriali 3.7-fol....
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Risultati
Come esempio dell'uso del test FTA, un topo BALB / c è stato immunizzato con il virus vaccinia ricombinante (VV) esprimere epitopi di HIV-I (VV-HIV) e le risposte alle epitopi di HIV-I CTL, Gag, mut Gag, Env e Pol, il VV CTL epitopi F2L e F2L mut, e l'epitopo cellule HIV-I T H, Gag Th (come descritto al punto 2), sono stati valutati utilizzando un parametro di 252 FTA test (Figura 1B). Varianti epitopo Gag (mut Gag) e F2L (F2L MUT) non sono espressi nel vettore VV-HIV e qui.......
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Discussione
Il vantaggio di saggi basati FTA è che permettono la discriminazione di> 250 popolazioni di cellule bersaglio valida e perfettamente funzionante da un unico animale ospite mediante citometria a flusso. Questo fornisce un livello di complessità vivo flusso saggi in base citometria a che non è stato possibile prima. Ciò è evidenziato nei due esperimenti sugli animali indicati sopra, dove le risposte alle 7 epitopi virali distinte a 6 concentrazioni potrebbero essere monitorati in replicati di 6 contem.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal progetto Sovvenzioni # 1010395 (BQ e CP) e # 525431 (CR), e un programma di sovvenzioni # 455395 (CP) dalla Salute e medicina Consiglio Nazionale delle Ricerche in Australia, un Centro australiano per l'epatite e HIV Virologia EOI 2012 borsa di studio (CR e RJJ) e una sovvenzione da parte del Bootes Fondazione Gordon e Gretel (BQ e CR). Desideriamo ringraziare Harpreet Vohra e Michael Devoy per la loro eccellente mantenimento del laboratorio JCSMR FACS, Facility australiano Cancer Research Foundation Biomolecolare Resource, JCSMR, ANU, per la sintesi peptidica, e il Dr. David Boyle, CSIRO Laboratories Salute animale, Geelong, ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Siero fetale di vitello | Serana | FCS-500 | |
| CTV | Invitrogen | C34557 | |
| CFDA, SE | Invitrogen | C1157 | |
| CPD | eBioscience | 65-0840-90 | |
| anti-B220 PerCp-Cy5.5 | eBioscience | 110730 | |
| anti-CD69 viola brillante 605 | Biolegend | 104529 | |
| PKH-26 | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| Vortex | Scientific Industries Inc | ||
| Centrifuga | Eppendorf | ||
| Citometro a flusso (Fortessa o equivalente con sorgente laser blu, rossa e viola) | BD Bioscience |
Riferimenti
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R.
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Ristampe e permessi
