В сочетании ДНК-РНК Люминесцентная<em> В месте</em> Гибридизация (FISH) по изучению Х-хромосома инактивации в Дифференцированный Женский эмбриональных стволовых клеток мыши
Summary
Люминесцентная в гибридизация (FISH) позволяет обнаружить нуклеиновых кислот в их родной среде внутри клетки. Мы здесь опишем протокол для комбинированной, одновременного обнаружения РНК и ДНК с помощью FISH, который может быть использован для изучения инактивации Х-хромосомы в мышиных эмбриональных стволовых клеток.
Abstract
Флуоресцентный в гибридизация (FISH) представляет собой молекулярный метод, который позволяет обнаруживать нуклеиновых кислот в клетки. РЫБЫ ДНК часто используется в цитогенетики и диагностики рака, и может обнаружить аберрации генома, которые нередко имеют важное клиническое значение. РНК FISH может быть использован для обнаружения молекулы РНК в клетках и предоставил важную информацию в регуляции экспрессии генов. Сочетание ДНК и РНК FISH в одной камере технически сложным, так как условия, пригодные для ДНК FISH может быть слишком суровыми для хрупких, одноцепочечными молекул РНК. Мы здесь представляем легко применимый протокола, который позволит комбинированный, одновременное обнаружение Xist РНК и ДНК, кодируемый Х-хромосомы. Это в сочетании протокол FISH ДНК-РНК может, вероятно, быть применены к другим системам, в которых необходимо как РНК и ДНК, которые будут обнаружены.
Introduction
Изучение клеток и тканей с помощью флуоресцентной в гибридизация (FISH) с момента своего появления в конце 1970-х 1, позволило исследователям изучить гены, организации хроматина и экспрессии генов на субклеточном уровне. РЫБЫ ДНК часто используется в цитогенетики, кариотипирование 2, диагностики рака 3 и предимплантационной генетического скрининга 4, и имеет важную роль в молекулярных исследований 5-6, так как это позволяет обнаружить нуклеиновых кислот в их родной среде. Одноместный анализ экспрессии клеток РНК FISH может обнаружить родные первичных транскриптов и некодирующие РНК транскрибируется от хромосом, и дает преимущества с другими методами, которые оценивают экспрессию генов на уровне населения, в том числе, например, количественной ОТ-ПЦР, геном широкий анализ экспрессии или Северная блоттинга . Визуализируя РНК-транскриптов, происходящих непосредственно со своих сайтов происхождения, он, например, былзаметил, что экспрессия гена является стохастической 7, а иногда может быть аллельспецифический 8. Улучшения в технике даже позволяли обнаружение и количественное определение отдельных молекул мРНК в клетках 9-11.
Основной принцип состоит из FISH-гибридизации нуклеиновых кислот в клетке с зондом нуклеиновой кислоты с помощью высоко специфического Уотсон и Крик спаривания оснований. Зонд может быть прямо или косвенно обнаружено, что приводит к сигналу, который может быть визуализированы под микроскопом. Первоначальные попытки состоял из радиоактивно меченых зондов, которые имели недостатки основе по вопросам безопасности, ограниченного пространственного разрешения и способности обнаружить только один цель одновременно 12-14. Последующее развитие нерадиоактивных меток, включая флуорохромами, гаптенами и ферментов, позволило широкое распространение использование рыбы, как рутинной техники молекулярной биологии. РЫБЫ зонд либо могут быть непосредственно помечены fluorochROMES по химическому связыванию флуоресцентных молекул нуклеиновой кислоты в последовательности 15 и интеграции флуоресцентно меченых нуклеотидов 16-19, или зонд может быть косвенно визуализированных после интеграции гаптенов (в том числе биотин и дигоксигенин) и иммунологической детекции гаптенов на гаптен специфических антител, конъюгированных с люминесцентные репортер молекул 20-21. Последний подход позволяет усиление сигнала с помощью нескольких слоев флуоресцентно меченых антител, которые используются для повышения исходный сигнал, и позволяет обнаруживать РНК видов, которые экспрессируются на низких уровнях. Комбинируя прямые и косвенные методы маркировки и различные гаптенов, несколько целей могут быть одновременно визуализировать в пределах одной ячейки.
Одним из наиболее важных шагов в протоколах рыба гибридизация зонда к своей цели. Хотя теоретически, зонд специфически связываются только с его мишенью, на практике это специфичностьне всегда достигается, в качестве зондов могут связываться с гомологичными участками, и условия гибридизации не всегда будет идеальным для конкретного региона ДНК или РНК видов. После гибридизации моет, следовательно, особенно важное значение, поскольку они могут увеличивать строгость процедуры рыба, и может предотвратить неспецифическое связывание рыбы зондов, что приведет к высокому уровню фонового шума. Как Молекулы РНК одноцепочечную они могут быть легко гибридизуют с зондом FISH. В противоположность этому, двухцепочечной молекулы ДНК сначала должен стадии денатурации, после чего зонд может гибридизоваться. Это обычно достигается путем нагревания образца, что приводит к денатурации ДНК. Тем не менее, в этих тяжелых условиях, хрупкие, одноцепочечные молекулы РНК могут быть потеряны. Таким образом, в сочетании ДНК-РНК FISH требует значительного оптимизацию условий, и более технически сложным по сравнению с отдельной обнаружения только РНК или ДНК.
Здесь мы изложета Подробный протокол комбинированного, одновременного ДНК-РНК FISH, который позволил нам изучить Х-хромосома инактивации (XCI) в дифференциации женский мышиных эмбриональных стволовых клеток 22-24. XCI является одним из важнейших эпигенетические механизм женского эмбрионального развития 25, и приводит к хроматина и, следовательно, заставить замолчать одного из двух Х-хромосом в женских особей 26-27. Существенное значение для этого процесса является некодирующих РНК Xist 28-30, который регулируется RNF12 22-23 и Rex1 24 белков. Xist экспрессия становится активируется на будущей неактивной Х-хромосоме (Xi) во время эмбрионального развития или по дифференциации клеток ES в пробирке , и может распространяться по Х-хромосоме и тем самым привлечь хроматина ферменты, которые приводят к транскрипции закрытия Х-хромосоме 31. Это распространение Xist РНК могут быть визуализированы РНК FISH в виде покрытия на хромосоме Xнекоторых, который также упоминается как Xist облака. Поскольку женские стволовые клетки могут потерять один из своих Х-хромосом из-за нестабильности генома, мы и другие использовали комбинированную ДНК-РНК FISH учиться XCI, чтобы убедиться, что только кариотипически стабильные клетки оцениваются в анализе этого важного процесса 22,32 -34. Как и в любом молекулярной техники биологии, несколько различных отличные протоколы были опубликованы 35-38. Здесь мы представляем наш метод, начиная с индукции дифференцировки в ЭС клеток мыши, для фиксации клеток, маркировки рыбы зонды ник-трансляции, предварительной обработки основных клеток, чтобы позволить пермеабилизации и последующее поглощение зонд, гибридизация зонда мишенью, и, наконец, обнаружение зонда по флуоресцентно меченых антител. Протокол здесь представлены позволяет верный обнаружение Xist РНК и Х-хромосомы в течение двух дней, и основы этого метода, вероятно, могут быть адаптированы к аее системы и направления исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
В сочетании ДНК-РНК FISH может быть технически сложным, так как условия, пригодные для ДНК FISH может быть слишком жестким для менее стабильных молекул РНК. Некоторые подходы были применены для изучения как ДНК и РНК в одной камере, в обход необходимость одновременной инкубации с зондов обн…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank all previous and present members of the department of Reproduction and Development of the Erasmus MC for helpful and stimulating discussions during the past years. We also want to thank the three anonymous reviewers for providing helpful feedback. Work in the Gribnau lab is supported by funding from the Dutch research council (NWO-VICI) and an ERC starting grant.
Materials
| female mouse embryonic stem cells | will be made available upon request | ||
| mouse embryonic fibroblasts | can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g Millipore | ||
| ES cell culture medium | DMEM, 15% foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM ß-mercaptoethanol, and 1000 U ml-1 LIF. Filter sterilize and store at 4ºC for maximal 2 weeks. | ||
| LIF | Chemicon | ESG1107 | |
| DMEM | Invitrogen | 11960085 | |
| Fetal Calf Serum | Invitrogen | 10099141 | |
| Penicillin–streptomycin (100×) | Invitrogen | 15140-122 | |
| Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140-050 | |
| ß-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| ES cell differentiation medium | IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/l monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid | ||
| IMDM-Glutamax | Invitrogen | 31980-030 | |
| Ascorbic acid (50 mg/ml) | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| T25 cell culture dishes | Greiner Bio-one | 690160 | |
| 6-well cell culture dishes | Greiner Bio-one | 662160 | |
| cell culture grade PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS | Gibco | 25200-056 | |
| falcon tubes | Falcon | 352196 | |
| 24×24 mm coverslips | Menzle | 780882 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | prepare 4% PFA/PBS solutions, by dissolving PFA in PBS. Stir at 70 ᴼC until completely dissolved and cool down to room temperature. Aliquots can be stored at -20ᴼC |
| absolute 100% ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions |
| RNAse free water | Baxter | TKF7114 | |
| sterile filter tips | Rainin Bio Clean | GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F | |
| digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation) | Roche | 11745816910 | |
| biotin-labeling kit (Biotin Nick translation) | Roche | 11745824910 | |
| Sephadex G50 | Sigma-Aldrich | G5080 | |
| 2 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| sterilized cotton | |||
| eppendorf tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| yeast tRNA 10 mg/ml | Invitrogen | 15401-029 | |
| Salmon Sperm DNA 10 mg/ml | Invitrogen | 15632-011 | |
| mouse cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | 18440-016 | |
| eppendorf bench top microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
| Eppendorf Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| 2M NaAc, pH 5.6 | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| 50+ hybridization solution | 50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7 | ||
| formamide | Acros organics | 3272350000 | |
| dextran sulfate | Fluka | 31403 | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | prepare a 0.2% solution in RNAse free water, and add 84 µl 37% HCL per 100 ml |
| HCL, 37% solution | Fluka | 84422 | |
| object glasses | Starfrost | 8037/1 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | dilute to 2x SSC in RNAse free water |
| 10 mM Phosphate buffer, pH 7 | add 57.7 ml of 1M Na2HPO4 and 42.3 ml 1M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave | ||
| denaturation buffer | 70% Formamide/2xSSC/10mM phosphate buffer pH 7 | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| 2M Tris pH 7.5 solution | |||
| Tris-Saline-Tween washing solution (TST) | 100 ml 10x Saline, 50 ml 2M Tris, 500 µl Tween-20, add RNAse free water till 1 liter | ||
| 10x Saline solution | dissolve 85 g NaCl in 1 liter RNAse free H2O, and autoclave | ||
| Tris-Saline-BSA (TSBSA) | 500 μl 10x Saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml RNAse free H2O | ||
| BSA, purified, 100x | New England Biolabs | B9001S | |
| sheep-anti-dig antibody | Roche diagnostics | use 1:500 diluted in TSBSA | |
| rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
| goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
| mouse-anti-biotin antibody | Roche diagnostics | use 1:200 diluted in TSBSA | |
| donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
| goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
| Tris-Saline washing solution (TS) | 10 ml 10x Saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O | ||
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
| nail-varnish | |||
| fluorescent miscroscope |
Riferimenti
- Rudkin, G. T., Stollar, B. D. High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence. Nature. 265, 472-473 (1977).
- Imataka, G., Arisaka, O. Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY). Cell Biochem Biophys. 62, 13-17 (2012).
- Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
- Mastenbroek, S., et al. Preimplantation genetic screening: a systematic review and meta-analysis of RCTs. Hum Reprod Update. 17, 454-466 (2011).
- Martins-Taylor, K., Xu, R. H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 22-27 (2012).
- Rens, W., et al. Resolution and evolution of the duck-billed platypus karyotype with an X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5 male sex chromosome constitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16257-16261 (2004).
- Munsky, B., et al. Using gene expression noise to understand gene regulation. Science. 336, 183-187 (2012).
- Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
- Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Rep. 46, 65-72 (2013).
- Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. , 1-16 (2012).
- Femino, A. M., et al. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
- Buongiorno-Nardelli, M., Amaldi, F. Autoradiographic detection of molecular hybrids between RNA and DNA in tissue sections. Nature. 225, 946-948 (1970).
- Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
- John, H. A., et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature. 223, 582-587 (1969).
- Bauman, J. G., et al. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
- Wiegant, J., et al. In situ hybridization with fluoresceinated DNA. Nucleic Acids Res. 19, 3237-3241 (1991).
- Langer, P. R., et al. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 6633-6637 (1981).
- Manuelidis, L., et al. High-resolution mapping of satellite DNA using biotin-labeled DNA probes. J Cell Biol. 95, 619-625 (1982).
- Kislauskis, E. H., et al. Isoform-specific 3′-untranslated sequences sort alpha-cardiac and beta-cytoplasmic actin messenger RNAs to different cytoplasmic compartments. J Cell Biol. 123, 165-172 (1993).
- Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, 7331-7335 (1982).
- Corput, M. P., et al. Fluorescence in situ hybridization using horseradish peroxidase-labeled oligodeoxynucleotides and tyramide signal amplification for sensitive DNA and mRNA detection. Histochem Cell Biol. 110, 431-437 (1998).
- Jonkers, I., et al. RNF12 is an X-Encoded dose-dependent activator of X chromosome inactivation. Cell. 139, 999-101 (2009).
- Barakat, T. S., et al. RNF12 activates Xist and is essential for X chromosome inactivation. PLoS Genet. 7, (2011).
- Gontan, C., et al. RNF12 initiates X-chromosome inactivation by targeting REX1 for degradation. Nature. 485, 386-390 (2012).
- Lyon, M. F. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L). Nature. 190, 372-373 (1961).
- Barakat, T. S., Gribnau, J. X. chromosome inactivation in the cycle of life. Development. 139, 2085-2089 (2012).
- Augui, S., et al. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nat Rev Genet. 12, 429-442 (2011).
- Brown, C. J., et al. A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome. Nature. 349, 38-44 (1991).
- Brockdorff, N., et al. Conservation of position and exclusive expression of mouse Xist from the inactive X chromosome. Nature. 351, 329-331 (1991).
- Borsani, G., et al. Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome. Nature. 351, 325-329 (1991).
- Barakat, T. S., Gribnau, J. X chromosome inactivation and embryonic stem cells. Adv Exp Med Biol. 695, 132-154 (2010).
- Chaumeil, J., et al. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
- Okamoto, I., et al. Eutherian mammals use diverse strategies to initiate X-chromosome inactivation during development. Nature. 472, 370-374 (2011).
- Gribnau, J., et al. X chromosome choice occurs independently of asynchronous replication timing. J Cell Biol. 168, 365-373 (2005).
- Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
- Van Tine, B. A., et al. Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence. Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).
- Pollex, T., et al. Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center. Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).
- Chaumeil, J., et al. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
- Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).
- Meissner, A., et al. Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).
- Nichols, J., Ying, Q. L. Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture. Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).
