Kombineret DNA-RNA Fluorescent<em> In situ</em> Hybridisering (FISH) til at studere X-kromosom inaktivering differentieret hunmus embryonale stamceller

Summary

Fluorescerende in situ-hybridisering (FISH) muliggør påvisning af nukleinsyrer i deres native miljø i cellerne. Vi her beskrive en protokol for den kombinerede, samtidig påvisning af RNA og DNA ved hjælp af fisk, som kan bruges til at studere X-kromosom inaktivering i muse embryonale stamceller.

Abstract

Fluorescerende in situ-hybridisering (FISH) er en molekylær teknik, som muliggør påvisning af nukleinsyrer i celler. DNA FISH anvendes ofte i cytogenetik og kræftdiagnostik og kan påvise aberrationer af genomet, som ofte har vigtige kliniske konsekvenser. RNA FISH kan anvendes til påvisning af RNA-molekyler i celler og har givet vigtig indsigt i reguleringen af ​​genekspression. Ved at kombinere DNA og RNA fisk inden for den samme celle er teknisk udfordrende, da betingelser egnet til DNA FISH kan være for barsk for skrøbelige, enkeltstrengede RNA-molekyler. Vi her præsentere en let anvendelig protokol, som gør det muligt for kombineret, samtidig påvisning af Xist RNA og DNA kodet med X-kromosomer. Denne kombinerede DNA-RNA-FISH protokol kan sandsynligvis anvendes i andre systemer, hvor både RNA og DNA, der skal detekteres.

Introduction

Studere celler og væv ved hjælp af fluorescerende in situ hybridisering (FISH) har, siden den blev indført i slutningen af 1970'erne ^1, tillod forskerne at studere gener, kromatin organisation og genekspression på subcelleniveauet. DNA FISH anvendes ofte i cytogenetik, karyotyping ^2, kræftdiagnostik ³ og præ-implantation genetisk screening ^4, og har en vigtig rolle i molekylær forskning ^5-6, da det giver mulighed for påvisning af nukleinsyrer i deres eget miljø. Single analyse celleekspression af RNA FISH kan opdage indfødte primære udskrifter og noncoding RNA bliver transskriberet fra kromosomer, og giver fordele til andre teknikker, som vurderer genekspression på populationen, herunder for eksempel kvantitativ RT-PCR, genom bred udtryk analyse eller Northern blotting . Ved at visualisere RNA afskrifter oprindelse direkte fra deres websteder oprindelseslande, har det for eksempel væretbemærket, at genekspression er stokastisk ⁷ og kan undertiden være allelspecifik ^8. Forbedringer i teknik har endda tilladt detektion og kvantificering af enkelt mRNA molekyler i cellerne ^9-11.

Det grundlæggende princip i FISH består af hybridisering af nukleinsyrer i cellen til en nukleinsyre-probe ved hjælp af meget specifik Watson og Crick baseparring. Proben kan enten være direkte eller indirekte registreret, hvilket resulterer i et signal, som kan visualiseres mikroskopisk. Indledende forsøg bestod af radioaktivt mærkede prober, som havde ulemper baseret på sikkerhedsspørgsmål, begrænset rumlig opløsning og evnen til at opdage kun ét mål ad gangen ^12-14. Den senere udvikling af ikke-radioaktive mærker, herunder fluorokromer, haptener og enzymer, har gjort udbredt brug af fisk som en rutinemæssig molekylærbiologisk teknik. FISH-proben kan enten være direkte mærket med fluorochRomes ved kemisk kobling af fluorescerende molekyler nukleinsyresekvenser ¹⁵ og integration af fluorescensmærkede nukleotider ^16-19 eller proben indirekte kan visualiseres efter integration af haptener (herunder biotin og digoxigenin) samt immunologisk påvisning af haptener af hapten-specifikke antistoffer konjugeret til fluorescerende reportermolekyler ^20-21. Sidstnævnte fremgangsmåde giver signalforstærkning ved hjælp af flere lag af fluorescens-mærkede antistoffer, som anvendes til at forbedre det oprindelige signal, og muliggør detektering af RNA-arter, der er udtrykt ved lave niveauer. Ved at kombinere direkte og indirekte teknikker mærkningskrav og forskellige haptener, kan flere mål samtidigt visualiseres i samme celle.

Et af de vigtigste skridt i fisk protokoller er hybridisering af proben til sit mål. Selv om der i teorien vil en sonde specifikt binder kun til sit mål i praksis denne specificiteter ikke altid opnås, som prober kan binde til homologe regioner og hybridiseringsbetingelser vil ikke altid være ideel for en bestemt DNA-region eller RNA-arter. Post-hybridisering vasker er derfor af særlig betydning, da de kan øge stringensen i FISH proceduren, og kan forhindre uspecifik binding af fisk sonder, hvilket ville resultere i et højt niveau af baggrundsstøj. Da RNA molekyler enkelt er strandet de let kan hybridiseret til en FISH sonde. I modsætning hertil dobbeltstrenget DNA-molekyle skal først et denatureringstrin, hvorefter en probe kan hybridisere. Dette opnås sædvanligvis ved opvarmning af prøven, hvilket resulterer i denaturering af DNA'et. Men under disse hårde betingelser, skrøbelige, enkeltstrengede RNA-molekyler kan gå tabt. Derfor kombineret DNA-RNA FISH kræver betydelige optimering af betingelserne, og er mere teknisk udfordrende i forhold til den separate påvisning af kun RNA eller DNA.

Her præsentation vita detaljeret protokol af kombineret, samtidig DNA-RNA fisk, som har givet os mulighed for at studere X-kromosom inaktivering (XCI) differentiere hunmus embryonale stamceller ^22-24. XCI er en afgørende epigenetisk mekanisme for kvindelige fosterudvikling ²⁵ og resulterer i heterochromatinization og dermed undertrykkelse af en af de to X-kromosomer i kvindelige individer ^26-27. Afgørende for denne proces er noncoding RNA Xist ^28-30, som er reguleret af RNF12 ^22-23 og REX1 ²⁴ proteiner. Xist udtryk bliver opreguleret den fremtidige inaktive X-kromosom (Xi) under fosterudviklingen eller på ES-celle differentiering in vitro og kan spredes langs X-kromosom og dermed tiltrække chromatin remodeling enzymer, der resulterer i den transkriptionelle lukning af X-kromosomet ^31. Denne spredning af Xist RNA kan visualiseres ved RNA FISH som et overtræk af X chromonogle, som også betegnes som en Xist sky. Da kvindelige ES-celler kan miste en af deres X-kromosomer på grund genomisk instabilitet, har vi og andre ansat kombinerede DNA-RNA FISH at studere XCI, for at sikre, at kun karyotypiske stabile celler vurderes i analysen af denne vigtige proces ^{22,32 -34.} Som med enhver molekylærbiologisk teknik, har flere forskellige gode protokoller blevet offentliggjort ^35-38. Her præsenterer vi vores metode, startende fra induktion af differentiering i muse ES-celler, fiksering af celler, mærkning af fisk sonder af Nick-oversættelse, forbehandling af faste celler til at tillade permeabilisering og efterfølgende sonde optagelse, hybridisering af sonden til mål, og endelig påvisning af proben ved fluorescensmærkede antistoffer. Den her præsenterede protokol tillader den trofaste detektion af Xist RNA og X-kromosom inden for en frist på to dage, og det grundlæggende i denne teknik kan sandsynligvis tilpasses til othendes systemer og forskningsområder.

Protocol

1.. Induktion af differentiering i Female embryonale stamceller til Fremkald X kromosominaktivering BEMÆRK: hunmus embryonale stamceller (kan rekvireres) dyrkes under standard ES celle betingelser på gelatiniserede kultur retter belagt med muse embryonale fibroblaster (MEF). Vi her antager, at læseren er bekendt med standard celledyrkningsteknikker 39-41. For at inducere differentiering, vil ES-celler dyrket i T25 retter adskilles fra MEF'er og vil blive udpladet i differenti…

Representative Results

Ved hjælp af ovennævnte protokol til kombineret DNA-RNA FISH, har vi været i stand til at visualisere X-kromosom inaktivering differentiere kvindelige embryonale stamceller. Figur 1 viser et repræsentativt eksempel på en DNA-RNA FISH eksperiment, hvor vi konstateret både Xist (som er synlig som en såkaldt Xist RNA sky på det inaktive X-kromosom og en basal transkription lokalisere det aktive X-kromosom), og en region af X-kromosomet, som er synlig som en knivskarp signal. Bemæ…

Discussion

Kombineret DNA-RNA FISH kan være teknisk udfordrende, da betingelser egnet til DNA FISH kan være for barsk for mindre stabile RNA-molekyler. Adskillige fremgangsmåder er blevet anvendt til at undersøge både DNA og RNA i den samme celle, omgår behovet for samtidig inkubation med prober påvisning både DNA og RNA. For eksempel i en overlejring fremgangsmåde er første RNA-FISH udført, og cellerne afbildes, og koordinaterne er taget. Efterfølgende samme objektglas anvendt til DNA-FISH, hvor signalet i RNA FISH er…

Materials

female mouse embryonic stem cells			will be made available upon request
mouse embryonic fibroblasts			can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g Millipore
ES cell culture medium			DMEM, 15% foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM ß-mercaptoethanol, and 1000 U ml-1 LIF. Filter sterilize and store at 4ºC for maximal 2 weeks.
LIF	Chemicon	ESG1107
DMEM	Invitrogen	11960085
Fetal Calf Serum	Invitrogen	10099141
Penicillin–streptomycin (100×)	Invitrogen	15140-122
Non-essential aminoacids	Invitrogen	11140-050
ß-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522
ES cell differentiation medium			IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/l monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid
IMDM-Glutamax	Invitrogen	31980-030
Ascorbic acid (50 mg/ml)	Sigma-Aldrich	A4403
monothioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145
T25 cell culture dishes	Greiner Bio-one	690160
6-well cell culture dishes	Greiner Bio-one	662160
cell culture grade PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS	Gibco	25200-056
falcon tubes	Falcon	352196
24×24 mm coverslips	Menzle	780882
gelatin	Sigma-Aldrich	G1890-100G	prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	prepare 4% PFA/PBS solutions, by dissolving PFA in PBS. Stir at 70 ᴼC until completely dissolved and cool down to room temperature. Aliquots can be stored at -20ᴼC
absolute 100%  ethanol	Sigma-Aldrich	32221-2.5L	use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions
RNAse free water	Baxter	TKF7114
sterile filter tips	Rainin Bio Clean	GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation)	Roche	11745816910
biotin-labeling kit (Biotin Nick translation)	Roche	11745824910
Sephadex G50	Sigma-Aldrich	G5080
2 ml syringe	BD Plastipak	300013
sterilized cotton
eppendorf tubes	Eppendorf	30120086
yeast tRNA 10 mg/ml	Invitrogen	15401-029
Salmon Sperm DNA 10 mg/ml	Invitrogen	15632-011
mouse cot-1 DNA  1 mg/ml	Invitrogen	18440-016
eppendorf bench top microcentrifuge	Eppendorf	Model 5417R
Eppendorf Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R
2M NaAc, pH 5.6	Sigma-Aldrich	S7670
50+ hybridization solution			50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7
formamide	Acros organics	3272350000
dextran sulfate	Fluka	31403
pepsin	Sigma-Aldrich	P6887	prepare a 0.2% solution in RNAse free water, and add 84 µl 37% HCL per 100 ml
HCL, 37% solution	Fluka	84422
object glasses	Starfrost	8037/1
20x SSC	Invitrogen	AM9763	dilute to 2x SSC in RNAse free water
10 mM Phosphate buffer, pH 7			add 57.7 ml of 1M Na2HPO4 and 42.3 ml 1M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave
denaturation buffer			70% Formamide/2xSSC/10mM phosphate buffer pH 7
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287
2M Tris pH 7.5 solution
Tris-Saline-Tween washing solution (TST)			100 ml 10x Saline, 50 ml 2M Tris, 500 µl Tween-20, add RNAse free water till 1 liter
10x Saline solution			dissolve 85 g NaCl in 1 liter RNAse free H2O, and autoclave
Tris-Saline-BSA (TSBSA)			500 μl 10x Saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml RNAse free H2O
BSA, purified, 100x	New England Biolabs	B9001S
sheep-anti-dig antibody	Roche diagnostics		use 1:500 diluted in TSBSA
rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC	Jackson labs		use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC	Jackson labs		use 1:250 diluted in TSBSA
mouse-anti-biotin antibody	Roche diagnostics		use 1:200 diluted in TSBSA
donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine	Jackson labs		use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine	Jackson labs		use 1:250 diluted in TSBSA
Tris-Saline washing solution (TS)			10 ml 10x Saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O
Vectashield mounting medium with DAPI	Vectorlabs	H-1200
nail-varnish
fluorescent miscroscope