ADN-ARN combiné Fluorescent<em> In situ</em> Hybridation (FISH) à étudier inactivation du chromosome X dans différencié Femme Souris cellules souches embryonnaires
Summary
Hybridation in situ fluorescente (FISH) permet la détection d'acides nucléiques de leur environnement natif dans les cellules. Nous décrivons ici un protocole pour le combiné, la détection simultanée de l'ARN et de l'ADN à l'aide de FISH, qui peut être utilisée pour étudier l'inactivation du chromosome X dans les cellules souches embryonnaires de souris.
Abstract
Hybridation in situ fluorescente (FISH) est une technique moléculaire qui permet la détection d'acides nucléiques dans les cellules. ADN FISH est souvent utilisée en cytogénétique et diagnostic du cancer, et peut détecter des aberrations du génome, qui a souvent des implications cliniques importantes. ARN FISH peut être utilisée pour détecter des molécules d'ARN dans les cellules et a fourni des renseignements importants dans la régulation de l'expression génique. La combinaison de l'ADN et de l'ARN FISH dans la même cellule est techniquement difficile, que des conditions appropriées pour l'ADN poisson pourrait être trop sévère pour fragiles, molécules d'ARN simple brin. Nous présentons ici un protocole facilement applicable qui permet au combiné, la détection simultanée de Xist ARN et l'ADN codé par les chromosomes X. Ce protocole de FISH ADN-ARN susceptible combiné peut être appliquée à d'autres systèmes où à la fois l'ARN et de l'ADN devant être détecté.
Introduction
Étudier les cellules et les tissus au moyen d'hybridation fluorescente in situ (FISH) a, depuis son introduction à la fin des années 1970 1, a permis aux chercheurs d'étudier les gènes, l'organisation de la chromatine et l'expression des gènes au niveau subcellulaire. ADN FISH est fréquemment utilisée en cytogénétique, caryotype 2, le diagnostic du cancer 3 et pré-implantatoire dépistage génétique 4, et joue un rôle important dans la recherche moléculaire 5-6, car il permet la détection d'acides nucléiques dans leur environnement naturel. Simple analyse d'expression de cellules par l'ARN FISH peut détecter des transcrits primaires indigènes et ARN non codantes étant transcrit à partir de chromosomes, et offre des avantages à d'autres techniques qui évaluent l'expression des gènes au niveau de la population, y compris par exemple RT-PCR quantitative, génome large analyse de l'expression ou Northern blot . En visualisant des transcrits d'ARN provenant directement de leurs sites d'origine, il a par exemple étéa remarqué que l'expression du gène est stochastique 7, et peut être parfois allèle spécifique 8. L'amélioration de la technique ont même permis la détection et la quantification des molécules d'ARNm dans les cellules simples 9-11.
Le principe de base de l'hybridation FISH consiste en des acides nucléiques dans la cellule à une sonde d'acide nucléique au moyen de Watson et Crick d'appariement de bases hautement spécifiques. La sonde peut être directement ou indirectement détectée, résultant en un signal qui peut être visualisée au microscope. Les premières tentatives étaient composés de sondes marquées radioactivement, qui avaient inconvénients en fonction des questions de sécurité, la résolution spatiale limitée et la capacité de détecter une seule cible à la fois 12-14. Le développement ultérieur d'étiquettes non radioactives, y compris les fluorochromes, les haptènes, et des enzymes, a permis l'utilisation répandue de FISH comme une technique de biologie moléculaire de routine. La sonde FISH peut être soit directement marqué avec fluorochromes par liaison chimique des molécules fluorescentes de l'acide nucléique et des séquences de 15 nucleotides de l'intégration de 16 à 19 marquées par fluorescence, ou la sonde peut être visualisé indirectement après intégration des haptènes (y compris la biotine et la digoxigénine) et la détection immunologique d'anticorps spécifiques d'haptènes par haptène conjugué à rapporteur fluorescent molécules 20-21. Cette dernière approche permet une amplification du signal à l'aide de plusieurs couches d'anticorps marqués par fluorescence qui sont utilisés pour améliorer le signal d'origine et permet la détection de l'espèce d'ARN qui sont exprimés à des niveaux faibles. En combinant des techniques de marquage direct et indirect et des haptènes différents, plusieurs cibles peuvent être visualisées simultanément dans la même cellule.
Une des étapes les plus importantes dans les protocoles de poisson est l'hybridation de la sonde à sa cible. Bien qu'en théorie, une sonde se lier spécifiquement seulement à sa cible, dans la pratique, cette spécificitén'est pas toujours atteint, en tant que sondes peuvent se lier à des régions homologues, des conditions d'hybridation et ne seront pas toujours idéale pour une certaine espèce de la région d'ADN ou d'ARN. Les lavages post-hybridation sont donc d'une importance particulière, car ils peuvent augmenter la rigueur de la procédure de FISH, et peuvent empêcher la liaison non spécifique des sondes FISH, qui se traduirait par un niveau élevé de bruit de fond. Comme les molécules d'ARN sont simple brin, ils peuvent facilement être hybridées à une sonde FISH. En revanche, la molécule d'ADN double brin doit tout d'abord une étape de dénaturation, après quoi, une sonde peut s'hybrider. Ceci est généralement obtenu par chauffage de l'échantillon, ce qui entraîne la dénaturation de l'ADN. Cependant, dans ces conditions difficiles, fragiles, molécules d'ARN simple brin peuvent être perdues. Par conséquent, l'ADN-ARN combiné FISH nécessite l'optimisation des conditions importantes, et il est plus difficile techniquement par rapport à la détection de seulement séparée de l'ARN ou de l'ADN.
Ici, nous présentationta protocole détaillé de combinés, simultanée FISH ADN-ARN qui nous a permis d'étudier l'inactivation du chromosome X (XCI) dans la différenciation des cellules souches embryonnaires de souris femelle 22-24. XCI est un mécanisme épigénétique cruciale pour le développement embryonnaire femelle 25, et les résultats en hétérochromatinisation et donc faire taire l'un des deux chromosomes X chez les individus de sexe féminin 26-27. Essentiel de ce processus est la non codantes de l'ARN Xist 28-30, qui est réglementée par les 24 protéines RNF12 22-23 et Rex1. Expression de Xist devient régulée à la hausse sur l'avenir chromosome X inactif (Xi) au cours du développement embryonnaire ou sur la différenciation des cellules ES in vitro , et peuvent se répandre le long du chromosome X et d'attirer ainsi remodelage de la chromatine enzymes qui entraînent la fermeture de la transcription du chromosome X 31. Cet étalement de Xist ARN peut être visualisée par FISH ARN en tant que revêtement du chromosome Xcertains, qui est aussi appelé un nuage de Xist. Comme les cellules ES femmes peuvent perdre un de leurs chromosomes X en raison de l'instabilité génomique, nous et d'autres avons utilisé combiné ADN-ARN FISH pour étudier XCI, pour s'assurer que les cellules ne caryotype stables sont évalués dans l'analyse de cet important processus 22,32 -34. Comme avec toutes les techniques de la biologie moléculaire, plusieurs excellents différents protocoles ont été publiés 35-38. Ici, nous présentons notre méthode, à partir de l'induction de la différenciation des cellules ES de souris, la fixation des cellules, l'étiquetage du poisson sondes par Nick-traduction, pré-traitement des cellules fixées pour permettre la perméabilisation et l'utilisation de la sonde suite, l'hybridation de la sonde à l' cible, et enfin la détection de la sonde par des anticorps marqués par fluorescence. Le protocole présenté ici permet la détection de fidèles ARN Xist et le chromosome X dans un délai de deux jours, et les bases de cette technique peut probablement être adapté à otses systèmes et domaines de recherche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Combiné ADN-ARN FISH peut être techniquement difficile, que des conditions appropriées pour l'ADN FISH peuvent être trop sévère pour les molécules d'ARN moins stables. Plusieurs approches ont été appliquées pour étudier à la fois l'ADN et l'ARN dans la même cellule, contournant le besoin d'incubation simultanée avec des sondes de détection à la fois l'ADN et l'ARN. Par exemple, dans une approche de superposition, premier poisson d'ARN est réalisée, et les cellules sont i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank all previous and present members of the department of Reproduction and Development of the Erasmus MC for helpful and stimulating discussions during the past years. We also want to thank the three anonymous reviewers for providing helpful feedback. Work in the Gribnau lab is supported by funding from the Dutch research council (NWO-VICI) and an ERC starting grant.
Materials
| female mouse embryonic stem cells | will be made available upon request | ||
| mouse embryonic fibroblasts | can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g Millipore | ||
| ES cell culture medium | DMEM, 15% foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM ß-mercaptoethanol, and 1000 U ml-1 LIF. Filter sterilize and store at 4ºC for maximal 2 weeks. | ||
| LIF | Chemicon | ESG1107 | |
| DMEM | Invitrogen | 11960085 | |
| Fetal Calf Serum | Invitrogen | 10099141 | |
| Penicillin–streptomycin (100×) | Invitrogen | 15140-122 | |
| Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140-050 | |
| ß-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| ES cell differentiation medium | IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/l monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid | ||
| IMDM-Glutamax | Invitrogen | 31980-030 | |
| Ascorbic acid (50 mg/ml) | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| T25 cell culture dishes | Greiner Bio-one | 690160 | |
| 6-well cell culture dishes | Greiner Bio-one | 662160 | |
| cell culture grade PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS | Gibco | 25200-056 | |
| falcon tubes | Falcon | 352196 | |
| 24×24 mm coverslips | Menzle | 780882 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | prepare 4% PFA/PBS solutions, by dissolving PFA in PBS. Stir at 70 ᴼC until completely dissolved and cool down to room temperature. Aliquots can be stored at -20ᴼC |
| absolute 100% ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions |
| RNAse free water | Baxter | TKF7114 | |
| sterile filter tips | Rainin Bio Clean | GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F | |
| digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation) | Roche | 11745816910 | |
| biotin-labeling kit (Biotin Nick translation) | Roche | 11745824910 | |
| Sephadex G50 | Sigma-Aldrich | G5080 | |
| 2 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| sterilized cotton | |||
| eppendorf tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| yeast tRNA 10 mg/ml | Invitrogen | 15401-029 | |
| Salmon Sperm DNA 10 mg/ml | Invitrogen | 15632-011 | |
| mouse cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | 18440-016 | |
| eppendorf bench top microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
| Eppendorf Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| 2M NaAc, pH 5.6 | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| 50+ hybridization solution | 50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7 | ||
| formamide | Acros organics | 3272350000 | |
| dextran sulfate | Fluka | 31403 | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | prepare a 0.2% solution in RNAse free water, and add 84 µl 37% HCL per 100 ml |
| HCL, 37% solution | Fluka | 84422 | |
| object glasses | Starfrost | 8037/1 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | dilute to 2x SSC in RNAse free water |
| 10 mM Phosphate buffer, pH 7 | add 57.7 ml of 1M Na2HPO4 and 42.3 ml 1M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave | ||
| denaturation buffer | 70% Formamide/2xSSC/10mM phosphate buffer pH 7 | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| 2M Tris pH 7.5 solution | |||
| Tris-Saline-Tween washing solution (TST) | 100 ml 10x Saline, 50 ml 2M Tris, 500 µl Tween-20, add RNAse free water till 1 liter | ||
| 10x Saline solution | dissolve 85 g NaCl in 1 liter RNAse free H2O, and autoclave | ||
| Tris-Saline-BSA (TSBSA) | 500 μl 10x Saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml RNAse free H2O | ||
| BSA, purified, 100x | New England Biolabs | B9001S | |
| sheep-anti-dig antibody | Roche diagnostics | use 1:500 diluted in TSBSA | |
| rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
| goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
| mouse-anti-biotin antibody | Roche diagnostics | use 1:200 diluted in TSBSA | |
| donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
| goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
| Tris-Saline washing solution (TS) | 10 ml 10x Saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O | ||
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
| nail-varnish | |||
| fluorescent miscroscope |
Riferimenti
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