Un canal cellulaire attaché patch-clamp enregistrement

Summary

Décrit ici est un procédé d'obtention de longues étendues de l'enregistrement en cours d'un canal ionique avec la technique de patch-clamp cellule attachée. Cette méthode permet d'observer, en temps réel, le modèle de conformations ouverture-fermeture de canal qui sous-tendent le signal biologique. Ces données renseignent sur les propriétés du canal dans les membranes biologiques intactes.

Abstract

Protéines de canaux ioniques sont des dispositifs universels de communication rapide à travers les membranes biologiques. La signature temporelle du flux ionique qu'ils génèrent dépend des propriétés intrinsèques de chaque protéine de canal ainsi que le mécanisme par lequel il est généré et contrôlé et représente un domaine important de la recherche actuelle. D'informations sur la dynamique de fonctionnement des protéines de canal ionique peut être obtenue par l'observation de longues étendues de courant produites par une seule molécule. Décrit ici est un protocole permettant d'obtenir un canal de patch-clamp enregistrements actuels attachés cellulaires pour un canal ionique ligand fermée, le récepteur de NMDA, exprimé de manière hétérologue dans des cellules HEK293 ou nativement dans les neurones corticaux. Également des instructions sur la façon d'adapter la méthode à d'autres canaux ioniques d'intérêt en présentant l'exemple du canal PIEZO1 mécano-sensible. Cette méthode peut fournir des données concernant les propriétés de conductance de la chaîne et la séquence temporelle de l'OPEconformations n-fermées qui constituent le mécanisme d'activation de la chaîne, aidant ainsi à comprendre leurs fonctions en matière de santé et de la maladie.

Introduction

Communication rapide à travers les membranes biologiques repose presque exclusivement sur les oligomères pores formant les protéines membranaires, communément appelées canaux. Ces protéines sont très différentes dans les signaux d'activation, les mécanismes de déclenchement et les propriétés de conductance. protéines de la Manche dont les pores sont sélectifs pour les ions sont classés comme des canaux ioniques; leur activation produit des courants ioniques à travers la membrane, et leurs réponses peuvent être enregistrées avec une haute résolution en temps réel en utilisant des techniques électrophysiologiques. Les signaux d'activation couvrent un large éventail de produits chimiques et physiques, y compris des gradients de concentration, les forces mécaniques et électriques, et de la température; ainsi, une classification supplémentaire des canaux ioniques dans ligand fermée, mécano, tension fermée, ou types sensibles à la chaleur. Dans cet article, les protocoles sont décrits pour enregistrer l'activité d'un canal à partir d'un canal de ligand fermée, le récepteur de NMDA, et d'un canal mécanosensible, PIEZO1, en utilisant la technique de patch-clamp.0;

Patch-clamp électrophysiologie est le premier et le plus largement utilisé la méthode expérimentale suffisamment sensible pour permettre l'observation de molécules simples ^{1, 2.} En plus de cette sensibilité exquise, il a considérablement élargi les préparations biologiques qui se prêtent à l'enregistrement électrophysiologique et a également permis l'observation des canaux ioniques dans les membranes intactes. Tout d'abord, parce que les deux serrage de tension et l'enregistrement de courant sont réalisées avec la même électrode, il peut être utilisé pour enregistrer des signaux à travers les petites membranes des cellules ou des patchs. La technique a révélé que les canaux ioniques sont pas limités à membranes excitables des muscles de la grenouille, electroplaques d'anguilles, ou axones géants de calmar ^{3, 4,} mais plutôt qu'ils représentent appareils omniprésents de mécanismes de signalisation transmembranaires et sont intrinsèques à tous les types de membranes cellulaires des uni-ou organismes multicellulaires, et aussi à des membranes intracellulaires. Importerantly, la capacité d'enregistrer des courants transmembranaires en attachant simplement une pipette en verre à une cellule intacte l'occasion sans précédent pour enregistrer l'activité de canaux ioniques dans leurs membranes natives sans perturbation. Ainsi, l'attaché technique de patch-clamp cellule, qui est décrite dans ce protocole, permet le suivi de l'activité des canaux ioniques en continu pendant des dizaines de minutes ou plus dans leur environnement naturel.

Sous fluctuations thermiques normales, toutes les protéines, y compris les protéines de canaux ioniques, subissent des changements structuraux sur une échelle de temps grande, avec les réarrangements les plus rapides et les plus fréquemment représentés le plus probable par les mouvements de la chaîne latérale et beaucoup plus lentes modifications et moins fréquentes représentés par le repositionnement de l'ensemble de des domaines ou des sous-unités, ou dans certains cas par des modifications post-traductionnelles ou des interactions protéine-protéine ^{5, 6.} Observant de longues périodes d'activité générés par une molécule peut aider à comprendre la fonctiondynamique internationales des canaux ioniques dans les membranes intactes physiologiques et fournit des informations précieuses sur le mécanisme de fonctionnement de la molécule observée.

Contrairement à la compréhension croissante de la diversité des canaux ioniques dans des types de cellules et les stades de développement, les connaissances sur la composition moléculaire des canaux ioniques dans les membranes natives est encore limitée. Tous les canaux ioniques sont des protéines multimériques et la majorité des canaux ioniques natifs assembler à partir de plusieurs types de sous-unités produisant des protéines de grande diversité moléculaire, qui est souvent accompagnée par des propriétés de conductance et de déclenchement divers. Pour cette raison, les canaux ioniques de la composition moléculaire définie sont étudiés lors de l'expression dans des systèmes hétérologues. En particulier, les cellules HEK293, qui sont une lignée clonale de cellules embryonnaires de rein humaines immortalisées ^7, acquis une large acceptation en tant que le système préféré pour l'expression hétérologue des canaux ioniques recombinants. Parmi l'hommeavantages y qui a élevé les cellules HEK293 que le système de choix pour les canaux ioniques électrophysiologie sont la facilité et l'accessibilité de la culture et le maintien de cultures à long terme stables, leur capacité à mener à bien pliage post-traductionnelle, la transformation et le trafic de protéines de mammifères, et dans de nombreux cas , leur faible niveau voire l'absence d'expression endogène pour le canal d'intérêt ^{7, 8.} Exprimant canaux ioniques recombinantes et d'étudier leurs propriétés fonctionnelles dans les cellules HEK293 continue d'être une approche intéressante pour obtenir des informations sur les propriétés de structure-fonction des canaux ioniques ainsi que les propriétés spécifiques des isoformes de canaux ioniques et leurs rôles dans le tissu natif. Les protocoles décrits dans cet article peuvent être appliquées aussi bien aux canaux ioniques recombinants exprimés dans des cellules HEK293 et ​​de canaux ioniques natifs.

En résumé, la technique de patch-clamp, grâce à sa capacité sans précédent pour résoudre le signals d'une molécule demeure, à ce jour, la méthode la plus directe pour observer le comportement des molécules simples. Dans son mode cellule attachée, l'enregistrement de patch-clamp permet longues périodes d'observation qui, après l'avoir fait pour une molécule, peuvent fournir des renseignements de qualité exceptionnelle dans le fonctionnement des canaux ioniques. Ci-dessous est présenté un protocole permettant d'obtenir des enregistrements de courant à haute résolution à partir de patchs attachés de cellules contenant une protéine de canal ionique.

Protocol

1. Culture cellulaire et l'expression des protéines Maintenir des cellules HEK293 (numéro ATCC CRL-1573) entre les passages 22 et 40, qui comprend des passages effectués par l'ATCC, en culture monocouche dans du milieu DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / mélange streptomycine à 5% de CO 2 et 37 ° C. Entre expériences, les cellules de passage dans des flacons T25 à 5-20 dilutions dans un volume final de 10 ml. Remarque: En utilisant des ce…

Representative Results

Recombinant récepteurs NMDA Récepteurs NMDA se lient et de répondre à l'action concomitante des deux co-agonistes: glutamate et la glycine. Ils assemblent comme hétérotétramères de deux sous-unités glycine GluN1 et sous-unités GluN2 liaison deux glutamate de liaison. Sous-unités GluN2 sont codés par quatre gènes (AD) et de ces formes les plus largement transcrites dans le cerveau sont GluN2A chez les adultes et chez les animaux jeunes GluN2B. En raison de la…

Discussion

Dans le domaine de canal ionique, un domaine important de la recherche est consacrée à la compréhension de la séquence d'événements qui conduit à la voie d'ouverture ou le mécanisme de déclenchement de la voie. Pour la plupart des canaux, ce processus est complexe et implique plusieurs étapes cinétiques qui ne peuvent être déduites à partir d'un signal multicanal macroscopique. En revanche, les expériences peuvent être conçus où l'observation de la séquence des événements ouverts / f…

Materials

Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1×51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1