Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Summary

Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Erlangung weite Strecken der aktuellen Aufnahme von einem Ionenkanal mit der Cell-Attached-Patch-Clamp-Technik. Diese Methode erlaubt die Beobachtung in Echtzeit, das Muster der Öffnungs-Schließ-Kanal-Konformationen, die die biologische Signal zugrunde liegen. Diese Daten informieren über Kanaleigenschaften in ungestörten biologischen Membranen.

Abstract

Ionenkanal-Proteine ​​sind universelle Geräte für die schnelle Kommunikation durch biologische Membranen. Die zeitliche Signatur des Ionenflusses erzeugen sie hängt von intrinsischen Eigenschaften zu jedem Kanalprotein sowie den Mechanismus, mit dem sie erzeugt und gesteuert und stellt einen wichtigen Bereich der aktuellen Forschung. Informationen über die Betriebsdynamik der Ionenkanal-Proteine ​​können durch Beobachten langen Strecken von Strom, der von einem einzigen Molekül produziert, erhalten werden. Hier beschrieben ist ein Protokoll zum Erhalten eines Kanal Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahmen Strom für einen Liganden abhängigen Ionenkanals des NMDA-Rezeptor heterolog in HEK293-Zellen oder nativ in kortikalen Neuronen exprimiert. Es werden auch Anweisungen, wie man die Methode auf andere Ionenkanäle von Interesse durch die Vorlage am Beispiel der mechanisch-sensitive Kanal PIEZO1 anzupassen. Dieses Verfahren kann Daten liefern hinsichtlich Leitfähigkeit Eigenschaften und der zeitlichen Abfolge der OPE des Kanalsn-Konformationen geschlossen, aus denen Aktivierungsmechanismus des Kanals, um dadurch ihre Funktionen in Gesundheit und Krankheit zu verstehen.

Introduction

Schnelle Kommunikation durch biologische Membranen erfolgt fast ausschließlich im oligomeren porenbildende Membranproteine, die allgemein als Kanäle bezeichnet. Diese Proteine ​​unterscheiden sich stark in Aktivierungssignale, Gating-Mechanismen und Leitfähigkeit Eigenschaften. Kanal-Proteine, deren Poren selektiv Ionen als Ionenkanäle klassifiziert; ihre Aktivierung produziert Ionenströme durch die Membran, und ihre Antworten können mit hoher Auflösung in Echtzeit mit Hilfe elektrophysiologischer Techniken aufgezeichnet werden. Die Aktivierungssignale umfassen eine breite Palette von chemischen und physikalischen Eingänge einschließlich Konzentrationsgradienten, mechanische und elektrische Kräfte und Temperatur; damit weiteren Klassifizieren Ionenkanäle in ligandenabhängigen, mechanosensitive, spannungsgesteuerten oder wärmeempfindliche Arten. In diesem Artikel werden Protokolle beschrieben, um Ein-Kanal-Aktivität aus einer ligandenabhängigen Kanal, den NMDA-Rezeptor und eine mechanosensitive Kanal, PIEZO1 aufzeichnen, mit der Patch-Clamp-Technik.0;

Patch-Clamp-Elektrophysiologie ist die erste und am meisten verwendete experimentelle Verfahren ausreichend empfindlich, um die Beobachtung von einzelnen Molekülen ^{1, 2} zu ermöglichen. Neben dieser ausgeprägte Empfindlichkeit hat es erheblich erweiterten die biologische Präparate zugänglich elektrophysiologischen Aufzeichnung und hat auch die Beobachtung von Ionenkanälen in intakten Membranen erlaubt. Erstens, weil beide Spannungsklemm und aktuelle Aufnahme mit der gleichen Elektrode erreicht, kann es verwendet werden, um Signale über kleine Zellen oder Membranen Flecken aufzuzeichnen. Die Technik ergab, dass Ionenkanäle sind nicht auf erregbare Membranen von Muskeln Frosch, Aal electroplaques, oder Tintenfisch Riesen Axone ^{3, 4,} sondern vielmehr, dass sie vertreten allgegenwärtigen Lampen der Transmembran-Signalmechanismen und sind untrennbar mit aller zellulären Membrantypen von uni-oder eingeschränkt mehrzelligen Organismen und auch intrazelluläre Membranen. Importantly, die Fähigkeit zur Transmembranströme durch einfaches Anbringen einer Glaspipette zu einer intakten Zelle aufnehmen, sofern die beispiellose Gelegenheit, um die Aktivität von Ionenkanälen in ihrer Mutter ungestörten Membranen aufnehmen. Somit ist die Zelle angeschlossen Patch-Clamp-Technik, die in diesem Protokoll beschrieben wird, ermöglicht die Kontrolle der Aktivität von Ionenkanälen kontinuierlich für zehn Minuten oder länger in ihrer natürlichen Umgebung.

Unter normalen Temperaturschwankungen, alle Proteine, einschließlich der Ionenkanal-Proteine ​​unterziehen strukturellen Veränderungen in einem breiten Zeitskala, mit den schnellsten und häufigsten Umlagerungen vertreten durch Seitenketten-Bewegungen und viel langsamer, weniger häufige Änderungen durch die Neupositionierung der gesamten dargestellten wahrscheinlich Domänen oder Untereinheiten oder in einigen Fällen durch posttranslationale Modifikationen oder Protein-Protein-Wechselwirkungen ^{5, 6.} Beobachten längere Tätigkeit, die ein Molekül erzeugt wird, kann helfen, die Funktion zu verstehenlen Dynamik der Ionenkanäle in intakten Membranen physiologischen und liefert wertvolle Informationen über den Betriebsmechanismus des betrachteten Molekül.

Im Gegensatz zu dem wachsenden Verständnis für die Vielfalt von Ionenkanälen in Zelltypen und Entwicklungsstadien, Wissen über die molekulare Zusammensetzung von Ionenkanälen in nativen Membranen noch immer begrenzt. Alle Ionenkanäle sind multimere Proteine ​​und die Mehrheit der nativen Ionenkanäle zusammen aus verschiedenen Arten von Untereinheiten Herstellung von Proteinen von breiten Molekular Vielfalt, die oft mit unterschiedlichen Leitfähigkeit und Gating Eigenschaften begleitet wird. Aus diesem Grund sind die Ionenkanäle von definierten molekularen Zusammensetzung nach Expression in heterologen Systemen untersucht. Insbesondere HEK293-Zellen, die eine klonale Linie von immortalisierten humanen embryonalen Nierenzellen ^7, gewonnen Akzeptanz als bevorzugte System zur heterologen Expression von rekombinanten Ionenkanäle. Unter den Manny Vorteile, die HEK293-Zellen als die Wahl System für Ionenkanal-Elektrophysiologie erhöht sind die einfache und kostengünstige Kultivierung und Pflege langlebige stabile Kulturen, ihre Fähigkeit zur Durchführung von post-translationale Faltung, Verarbeitung und Handel von Säugetierproteinen, und in vielen Fällen , ihrer geringen oder sogar Fehlen von endogenen Ausdruck für die interessierenden Kanal ^{7, 8.} Expression rekombinanter Ionenkanäle und das Studium ihrer funktionellen Eigenschaften in HEK293-Zellen nach wie vor ein wertvoller Ansatz, um Informationen über Struktur-Funktions-Eigenschaften von Ionenkanälen sowie die spezifischen Eigenschaften der Ionenkanal-Isoformen und ihre Rollen in nativem Gewebe zu erhalten. Die in diesem Artikel beschriebenen Protokolle können ebenso gut auf Ionenkanäle in rekombinanten HEK293 Zellen exprimiert und auf native Ionenkanäle verwendet werden.

Zusammenfassend ist die Patch-Clamp-Technik, durch seine beispiellose Fähigkeit zur Signal lösens von einem Molekül bleibt bis heute die direkteste Methode zur Beobachtung des Verhaltens von Einzelmolekülen. In seiner Cell-Attached-Modus ermöglicht Patch-Clamp-Aufzeichnung lange Beobachtungszeiträume, die, wenn für ein Molekül erfolgen kann außergewöhnliche Einsicht in den Betrieb der Ionenkanäle bereitzustellen. Unten ist ein Protokoll für den Erhalt hoher Auflösung aktuelle Aufnahmen aus der Zelle befestigt Patches ein Ionenkanal-Protein enthält, vorgestellt.

Protocol

1. Zellkultur und Proteinexpression Aufrechterhaltung HEK293-Zellen (ATCC-Nummer CRL-1573) zwischen den Durchgängen 22 und 40, die Durchgänge durch die ATCC geführt, in Monolayer-Kultur in DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) enthält und 1% Penicillin / Streptomycin-Gemisch bei 5% CO 2 und 37 ° C. Zwischen Experimenten Passage-Zellen in T25-Kolben 5-20 fachen Verdünnungen in einem Endvolumen von 10 ml gelöst. Hinweis: Die Verwendung dieser Zellen während der Passagen garantiert…

Representative Results

Rekombinante NMDA-Rezeptoren NMDA-Rezeptoren binden und auf die gleichzeitige Einwirkung von zwei mit-Agonisten: Glutamat und Glycin. Sie montieren wie Heterotetramere von zwei Glycin-Bindungs ​​GluN1 Untereinheiten und zwei Glutamat-Bindungs ​​GluN2 Untereinheiten. GluN2 Untereinheiten sind durch vier Gene (AD) und von diesen codiert die am häufigsten transkribiert Formen in Gehirn sind GluN2A bei Erwachsenen und GluN2B an Jungtieren. Aufgrund der Vielfalt von NMDA…

Discussion

In der Ionenkanal-Bereich wird ein wichtiger Bereich der Forschung zum Verständnis der Abfolge der Ereignisse, die zum Öffnen oder Gating-Mechanismus des Kanals Kanal führt gewidmet. Für die meisten Sender ist dieses Verfahren komplex und beinhaltet mehrere Bewegungsschritte, die nicht vom makroskopischen Mehrkanalsignal abgeleitet werden kann. Im Gegensatz dazu kann Experimenten beobachtet werden, wo die Reihenfolge der offene / geschlossene Veranstaltungen im Single Channel Datensatz kann detaillierte Informatione…

Materials

Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1×51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1