एक चैनल सेल संलग्न पैच दबाना रिकॉर्डिंग
Summary
यहाँ वर्णित सेल संलग्न पैच दबाना तकनीक के साथ एक आयन चैनल से वर्तमान रिकॉर्डिंग की लंबी हिस्सों प्राप्त करने के लिए एक प्रक्रिया है. इस विधि, वास्तविक समय में अवलोकन के लिए अनुमति देता है, जैविक संकेत कायम करना है कि खुले करीब चैनल रचना के पैटर्न. इन आंकड़ों अबाधित जैविक झिल्लियों में चैनल गुणों के बारे में सूचित करें.
Abstract
आयन चैनल प्रोटीन जैविक झिल्ली भर में तेजी से संचार के लिए यूनिवर्सल उपकरणों रहे हैं. वे उत्पन्न आयनिक प्रवाह के अस्थायी हस्ताक्षर प्रत्येक चैनल प्रोटीन के साथ ही यह उत्पन्न होता है और नियंत्रित किया जाता है जिसके द्वारा तंत्र को आंतरिक गुणों पर निर्भर करता है और वर्तमान अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है. आयन चैनल प्रोटीन का परिचालन गतिशीलता के बारे में सूचना एक ही अणु के द्वारा उत्पादित वर्तमान की लंबी हिस्सों देख द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. एक ligand gated आयन चैनल, NMDA रिसेप्टर के लिए एक चैनल सेल संलग्न पैच दबाना वर्तमान रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल यहाँ है वर्णित है, cortical न्यूरॉन्स में HEK293 कोशिकाओं में या natively heterologously व्यक्त किया. इसके अलावा mechano संवेदनशील चैनल PIEZO1 का उदाहरण पेश करके ब्याज की अन्य आयन चैनलों के लिए विधि अनुकूलित करने के निर्देश हैं प्रदान की. इस विधि चैनल के प्रवाहकत्त्व गुण और ope के अस्थायी अनुक्रम के बारे में डेटा प्रदान कर सकते हैंइस प्रकार स्वास्थ्य और रोग में उनके कार्यों को समझने में मदद करने, चैनल के सक्रियण तंत्र को बनाने वाली N-बंद रचना.
Introduction
जैविक झिल्ली भर में तेजी से संचार सामान्यतः चैनल के रूप में भेजा oligomeric ताकना गठन झिल्ली प्रोटीन, पर लगभग विशेष रूप से निर्भर करता है. ये प्रोटीन सक्रियण संकेतों, gating तंत्र, और प्रवाहकत्त्व गुणों में व्यापक रूप से भिन्न होते हैं. जिसका pores आयनों को चयनात्मक हैं चैनल प्रोटीन आयन चैनल के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं; उनके सक्रियण झिल्ली भर आयनिक धाराओं पैदा करता है, और अपनी प्रतिक्रिया electrophysiologic तकनीक का उपयोग कर वास्तविक समय में उच्च संकल्प के साथ दर्ज किया जा सकता है. सक्रियण संकेतों एकाग्रता ढ़ाल, मैकेनिकल और इलेक्ट्रिकल बलों, और तापमान सहित रासायनिक और भौतिक आदानों की एक व्यापक सरणी अवधि; इस प्रकार, आगे ligand में आयन चैनल वर्गीकृत, gated mechanosensitive, वोल्टेज gated, या गर्मी संवेदनशील प्रकार के. इस अनुच्छेद में, प्रोटोकॉल पैच दबाना तकनीक का उपयोग कर, एक ligand gated चैनल, NMDA रिसेप्टर, और एक mechanosensitive चैनल, PIEZO1 से एक चैनल गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए वर्णित हैं.0;
पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी एकल अणुओं 1, 2 के अवलोकन की अनुमति के लिए पर्याप्त रूप से संवेदनशील पहली और सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक विधि है. इस अति सुंदर संवेदनशीलता के अलावा, यह बेहद electrophysiologic रिकॉर्डिंग करने के लिए उत्तरदायी जैविक तैयारी का विस्तार किया गया है और यह भी बरकरार झिल्ली में आयन चैनल के अवलोकन की अनुमति दी है. वोल्टेज clamping और वर्तमान रिकॉर्डिंग दोनों एक ही इलेक्ट्रोड के साथ पूरा कर रहे हैं, क्योंकि सबसे पहले, यह छोटे कोशिकाओं या झिल्ली पैच भर में संकेत रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. तकनीक आयन चैनल मेंढक की मांसपेशियों, मछली electroplaques, या विद्रूप विशाल axons 3, 4, बल्कि वे transmembrane संकेतन तंत्र की देशव्यापी फिक्स्चर का प्रतिनिधित्व करते हैं और विश्वविद्यालय या की सभी सेलुलर झिल्ली प्रकार के आंतरिक कर रहे हैं कि के उत्तेजनीय झिल्ली तक ही सीमित नहीं रहे हैं कि पता चला बहुकोशिकीय जीव, और भी intracellular झिल्ली को. आयातantly, बस एक अक्षुण्ण सेल करने के लिए एक गिलास विंदुक संलग्न द्वारा transmembrane धाराओं रिकॉर्ड करने की क्षमता उनके पैतृक undisrupted झिल्ली में आयन चैनल से गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए अभूतपूर्व अवसर प्रदान किया. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में वर्णित है जो सेल संलग्न पैच दबाना तकनीक, मिनट के दसियों या उनके पैतृक वातावरण में लंबे समय तक के लिए लगातार आयन चैनलों की गतिविधि की निगरानी परमिट.
सामान्य थर्मल उतार चढ़ाव के तहत, आयन चैनल प्रोटीन सहित सभी प्रोटीन,, पक्ष श्रृंखला आंदोलनों और पूरे के repositioning द्वारा प्रतिनिधित्व बहुत धीमी है, कम लगातार परिवर्तन से सबसे अधिक संभावना प्रतिनिधित्व सबसे तेज और सबसे लगातार rearrangements के साथ, एक व्यापक समय के पैमाने पर संरचनात्मक परिवर्तन से गुजरना डोमेन या सब यूनिटों, या पोस्ट translational संशोधनों या प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत 5, 6 के द्वारा कुछ मामलों में. एक अणु के द्वारा उत्पन्न की गतिविधि की लंबी अवधि के अवलोकन समारोह को समझने में मदद कर सकते हैंराष्ट्रीय बरकरार शारीरिक झिल्ली में आयन चैनल की गतिशीलता और मनाया अणु का परिचालन तंत्र के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है.
सेल प्रकार के और विकास के चरणों में आयन चैनल, देशी झिल्ली में आयन चैनल की आणविक संरचना के बारे में ज्ञान की विविधता की बढ़ती समझ के विपरीत अभी भी सीमित है. सभी आयन चैनल multimeric प्रोटीन होते हैं और देशी आयन चैनल का बहुमत अक्सर विविध प्रवाहकत्त्व और gating संपत्तियों के साथ साथ है, जो विस्तृत आणविक विविधता, के प्रोटीन के उत्पादन यूनिटों के कई प्रकार से एकत्र कर लें. इस कारण से, परिभाषित आणविक संरचना के आयन चैनल heterologous प्रणाली में अभिव्यक्ति पर अध्ययन कर रहे हैं. विशेष रूप से, अमर मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं 7 का एक प्रतिरूप लाइन हैं जो HEK293 कोशिकाओं, पुनः संयोजक आयन चैनल का heterologous अभिव्यक्ति के लिए पसंदीदा प्रणाली के रूप में व्यापक स्वीकृति प्राप्त की. आदमी के बीचआयन चैनल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए चुनाव प्रणाली के रूप में HEK293 कोशिकाओं बुलंद है कि y फायदे आसानी और संवर्धन की खरीदने की क्षमता हैं और लंबे समय रहते स्थिर संस्कृतियों को बनाए रखने, बाद translational तह, प्रसंस्करण और स्तनधारी प्रोटीन की तस्करी से बाहर ले जाने के लिए उनकी क्षमता, और कई मामलों में , उनके कम स्तर या ब्याज 7, 8 चैनल के लिए अंतर्जात अभिव्यक्ति की भी अभाव. पुनः संयोजक आयन चैनल व्यक्त करने और HEK293 कोशिकाओं में उनके कार्यात्मक गुणों का अध्ययन संरचना समारोह आयन चैनल के गुणों के साथ ही आयन चैनल isoforms और देशी ऊतक में उनकी भूमिकाओं के विशिष्ट गुणों के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण होना जारी है. इस आलेख में वर्णित प्रोटोकॉल HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त पुनः संयोजक आयन चैनलों के लिए और देशी आयन चैनलों के लिए समान रूप से अच्छी तरह से लागू किया जा सकता है.
संक्षेप में, अपने अभूतपूर्व क्षमता के माध्यम से पैच दबाना तकनीक, संकेत हल करने के लिएएक अणु से है, आज तक, एकल अणुओं के व्यवहार के अवलोकन के लिए सबसे प्रत्यक्ष विधि बनी हुई है. अपने सेल संलग्न मोड में, पैच दबाना रिकॉर्डिंग एक अणु के लिए जब किया, आयन चैनल के आपरेशन में असाधारण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, जो लंबे समय से अवलोकन अवधि की अनुमति देता है. नीचे एक आयन चैनल प्रोटीन युक्त सेल संलग्न पैच से उच्च संकल्प वर्तमान रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
आयन चैनल क्षेत्र में अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र को खोलने या चैनल के gating तंत्र चैनल की ओर जाता है कि घटनाओं के अनुक्रम को समझने के लिए समर्पित है. सबसे चैनलों के लिए, इस प्रक्रिया जटिल है और एक macroscopic ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम F31NS086765 (KAC) द्वारा समर्थित किया गया था, F31NS076235 (एमएपी), और R01 NS052669 (GKP) और EIA9100012. लेखकों विशेषज्ञता और आणविक जीव विज्ञान और टिशू कल्चर के साथ सहायता के लिए Eileen Kasperek धन्यवाद; और जेसन मायर्स जल्दी प्रीफ्रंटल cortical न्यूरॉन्स से प्राप्त आंकड़ों को साझा करने के लिए.
Materials
| Chemicals | Sigma | Various | |
| Borosillicate Glass | Sutter | BF-150-86-10 | |
| Bright field inverted microscope | Olympus | 1×51 | Nikon also has similar microscopes |
| Fluroescent box | X-cite | Series 120 | |
| Liquid Light Guide | X-cite | OEX-LG15 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-225 | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS1001 | |
| Amplifier | Molecular Devices | Axon Axopatch 200B | |
| Table | TMC | 63561 | |
| NIDAQ card | National Instruments | 776844-01 | |
| Puller | Narishige | PC-10 | |
| Polisher | Narishige | Microforge MF-830 | |
| Faraday Cage | TMC | 8133306 | |
| High Speed Pressure Clamp | ALA Scientific Instruments | ALA HSPC | |
| Pressue/Vaccuum Pump | ALA Scientific Instruments | ALA PV-PUMP | For HSPC-1 |
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