Qui viene descritta una procedura per ottenere lunghi tratti di registrazione corrente da un canale ionico con la tecnica patch-clamp cell-attached. Questo metodo permette di osservare, in tempo reale, il modello di apertura-chiusura conformazioni di canale che stanno alla base del segnale biologico. Questi dati informano sulle proprietà dei canali nelle membrane biologiche inalterate.
Proteine canale Ion sono dispositivi universali per la comunicazione veloce attraverso le membrane biologiche. La firma temporale del flusso di ioni generano dipende dalle proprietà intrinseche di ciascuna proteina canale così come il meccanismo attraverso il quale è generato e controllato e rappresenta un'importante area di ricerca corrente. Informazioni sulle dinamiche operative delle proteine del canale ionico può essere ottenuta osservando lunghi tratti di corrente prodotte da una singola molecola. Qui descritto è un protocollo per ottenere patch-clamp registrazioni di corrente di un canale Cell-attached per una gated canale ionico ligando, il recettore NMDA, espresso eterologamente in cellule HEK293 o nativo in neuroni corticali. Sono fornite anche le istruzioni su come adattare il metodo per gli altri canali ionici di interesse presentando l'esempio del canale PIEZO1 meccano-sensibili. Questo metodo può fornire dati riguardanti le proprietà conduttanza del canale e la sequenza temporale di opeconformazioni n chiusi che compongono il meccanismo di attivazione del canale, contribuendo così a capire le loro funzioni in materia di salute e di malattia.
Comunicazione veloce attraverso le membrane biologiche si basa quasi esclusivamente su oligomeriche formanti pori proteine di membrana, comunemente indicato come canali. Queste proteine sono molto diverse in segnali di attivazione, meccanismi di gating, e le proprietà di conduttanza. Proteine canale cui pori sono selettivi per ioni sono classificati come canali ionici; la loro attivazione produce correnti ioniche attraverso la membrana, e le risposte possono essere registrati con alta risoluzione in tempo reale utilizzando tecniche elettrofisiologiche. I segnali di attivazione abbracciano una vasta gamma di input chimici e fisici, tra cui gradienti di concentrazione, forze meccaniche ed elettriche, e la temperatura; in tal modo, un ulteriore classificazione canali ionici in ligando recintato, meccanosensibili, tensione recintato, o tipi sensibili al calore. In questo articolo, i protocolli sono descritti per registrare l'attività di un canale da un canale ligando gated, il recettore NMDA, e un canale meccanosensibili, PIEZO1, utilizzando la tecnica del patch-clamp.0;
Patch-clamp elettrofisiologia è il primo e più diffuso metodo sperimentale sufficientemente sensibile per consentire l'osservazione di singole molecole 1, 2. In aggiunta a questa sensibilità squisita, ha potenziato notevolmente i preparati biologici suscettibili di registrazione elettrofisiologica e inoltre ha permesso l'osservazione dei canali ionici in membrane intatte. In primo luogo, perché entrambi serraggio tensione e corrente di registrazione sono realizzate con lo stesso elettrodo, può essere utilizzato per registrare segnali attraverso piccole cellule o membrane patch. La tecnica ha rivelato che i canali ionici non sono limitati alle membrane eccitabili dei muscoli della rana, electroplaques anguilla, o assoni giganti di calamaro 3, 4, ma piuttosto che essi rappresentano infissi onnipresenti di meccanismi di segnalazione transmembrana e sono intrinseci a tutti i tipi di membrane cellulari di uni-o organismi multicellulari, e anche alle membrane intracellulari. Importantly, la capacità di registrare le correnti transmembrana semplicemente collegando una pipetta di vetro di una cellula intatta fornito l'opportunità senza precedenti per registrare l'attività di canali ionici nelle loro membrane undisrupted nativi. Così, l'allegata patch-clamp cella, che è descritto in questo protocollo, consente il monitoraggio dell'attività di canali ionici ininterrottamente per decine di minuti o più nel loro ambiente nativo.
In normali fluttuazioni termiche, tutte le proteine, tra cui proteine del canale ionico, subiscono cambiamenti strutturali su vasta scala di tempo, con i riarrangiamenti più veloci e più frequenti rappresentato probabilmente dai movimenti della catena laterale e molto più lento, meno frequenti cambiamenti rappresentate dal riposizionamento dell'intero domini o subunità, o in alcuni casi di modificazioni post traduzionali o interazioni proteina-proteina 5, 6. Osservando lunghi periodi di attività generate da una molecola può aiutare a comprendere la funzionedinamica zionali di canali ionici in membrane fisiologiche intatte e fornisce preziose informazioni circa il meccanismo di funzionamento della molecola osservata.
In contrasto con la crescente comprensione della diversità dei canali ionici attraverso tipi di cellule e fasi di sviluppo, le conoscenze sulla composizione molecolare dei canali ionici in membrane native è ancora limitata. Tutti i canali ionici sono proteine multimeriche e la maggior parte dei canali ionici nativi assemblare da diversi tipi di subunità che producono proteine di diversità molecolare ampia, che è spesso accompagnata con conduttanza e gating diverse proprietà. Per questo motivo, canali ionici di composizione molecolare definita sono studiati su espressione in sistemi eterologhi. In particolare, cellule HEK293, che sono una linea clonale delle cellule renali embrionali umane immortalizzate 7, ampiamente accettato come il sistema preferito per l'espressione eterologa di canali ionici ricombinanti. Tra l'uomovantaggi y che le elevate cellule HEK293 come il sistema ideale per elettrofisiologia canale ionico sono la facilità e la convenienza di coltura e il mantenimento delle culture stabili di lunga durata, la loro capacità di svolgere post-traslazionale piegatura, l'elaborazione e il traffico di proteine di mammiferi, e in molti casi , il livello basso o addirittura assenza di espressione endogena per il canale di interesse 7, 8. Esprimendo canali ionici ricombinanti e studiare le loro proprietà funzionali in cellule HEK293 continua ad essere un valido approccio per ottenere informazioni sulle proprietà struttura-funzione dei canali ionici e le proprietà specifiche delle isoforme del canale ionico e il loro ruolo nel tessuto nativo. I protocolli descritti in questo articolo possono essere applicati ugualmente bene a canali ionici ricombinanti espressi in cellule HEK293 e canali ionici nativi.
In sintesi, la tecnica del patch-clamp, attraverso la sua capacità senza precedenti di risolvere segnales da una molecola rimane, ad oggi, il metodo più diretto per osservare il comportamento delle singole molecole. Nella sua modalità cella-attached, la registrazione patch-clamp consente lunghi periodi di osservazione che, se fatto per una molecola, può fornire indicazioni eccezionale sul funzionamento dei canali ionici. Qui di seguito viene presentato un protocollo per l'ottenimento di registrazioni correnti ad alta risoluzione da cellulari patch allegati contenenti una proteina del canale ionico.
Nel campo canale ionico, un area di ricerca è dedicata alla comprensione della sequenza di eventi che conduce al canale meccanismo di apertura o gating del canale. Per la maggior parte dei canali, questo processo è complesso e prevede diversi passaggi cinetici che non possono essere dedotti da un segnale multicanale macroscopico. Al contrario, gli esperimenti possono essere progettati in cui osservando la sequenza di eventi aperti / chiusi in record di singolo canale può produrre informazioni più dettagliate su gati…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato da F31NS086765 (KAC), F31NS076235 (MAP), e R01 NS052669 (GKP) e EIA9100012. Gli autori ringraziano Eileen Kasperek per la competenza e l'assistenza con la biologia molecolare e la cultura dei tessuti; e Jason Myers per la condivisione dei dati ottenuti dai primi neuroni corticali prefrontali.
Chemicals | Sigma | Various | |
Borosillicate Glass | Sutter | BF-150-86-10 | |
Bright field inverted microscope | Olympus | 1×51 | Nikon also has similar microscopes |
Fluroescent box | X-cite | Series 120 | |
Liquid Light Guide | X-cite | OEX-LG15 | |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-225 | |
Oscilloscope | Tektronix | TDS1001 | |
Amplifier | Molecular Devices | Axon Axopatch 200B | |
Table | TMC | 63561 | |
NIDAQ card | National Instruments | 776844-01 | |
Puller | Narishige | PC-10 | |
Polisher | Narishige | Microforge MF-830 | |
Faraday Cage | TMC | 8133306 | |
High Speed Pressure Clamp | ALA Scientific Instruments | ALA HSPC | |
Pressue/Vaccuum Pump | ALA Scientific Instruments | ALA PV-PUMP | For HSPC-1 |