En kanal Cell-festet Patch-clamp opptak

Summary

Beskrevet her er en prosedyre for å få lange strekninger av dagens opptak fra en ionekanal med celle-festet patch-clamp teknikken. Denne metoden gjør det mulig for å observere, i sanntid, mønsteret av open-nære kanal konformasjoner som ligger til grunn for biologisk signal. Disse dataene informere om kanal eiendommer i uforstyrrede biologiske membraner.

Abstract

Ionekanal proteiner er universelle enheter for rask kommunikasjon på tvers av biologiske membraner. Den temporale signaturen til det ioniske flussmiddel de genererer avhenger egenskaper iboende i hver kanal protein så vel som den mekanismen som er den genererte og kontrollert og er et viktig område for dagens forskning. Informasjon om operasjons dynamikken i ionekanal proteiner kan bli oppnådd ved å observere lange strekninger av strøm som er produsert av et enkelt molekyl. Beskrevet her er en protokoll for å skaffe en-kanals celle-festet patch-clamp dagens opptak for en ligand gated ionekanal, NMDA-reseptoren, uttrykt heterologt i HEK293 celler eller direkte i kortikale nevroner. Også gitt er instruksjoner om hvordan du kan tilpasse metoden til andre ionekanaler av interesse ved å presentere eksempel på mekano-sensitive kanal PIEZO1. Denne metoden kan gi data om kanalens konduktans egenskaper og det timelige sekvens av open lukkede konformasjoner som utgjør kanalens aktiveringsmekanismen, og dermed bidra til å forstå deres funksjon i helse og sykdom.

Introduction

Rask kommunikasjon på tvers av biologiske membraner er avhengig nesten utelukkende på oligomeriske pore forming membran proteiner, ofte referert til som kanaler. Disse proteinene er stor forskjell i aktiveringssignaler, gating mekanismer, og konduktans egenskaper. Kanal proteiner som porene er selektiv for ioner er klassifisert som ionekanaler; aktivering deres produserer ioniske strømmer gjennom membranen, og deres svar kan tas opp med høy oppløsning i sanntid ved hjelp av elektrofysiologiske teknikker. Aktiveringssignaler spenner over et bredt spekter av kjemiske og fysiske innganger, inkludert konsentrasjons graderinger, mekaniske og elektriske krefter, og temperatur; derfor videre klassifisere ionekanaler inn ligand gated, mechanosensitive, spenning gated, eller varme sensitive typer. I denne artikkelen er protokoller som er beskrevet for å ta opp en-kanal-aktivitet fra en ligand gated kanal, NMDA-reseptor, og en mechanosensitive kanal, PIEZO1, ved hjelp av patch clamp-teknikk.0;

Patch-clamp elektrofysiologi er den første og mest brukte eksperimentelle metoden tilstrekkelig følsom til å tillate observasjon av enkle molekyler ^{1, 2.} I tillegg til dette utsøkte følsomhet, har det vesentlig utvidet de biologiske preparater mottakelig for elektrofysiologiske opptak og også har gjort observasjon av ionekanaler i intakte membraner. Først, fordi begge spenningsklem og strøm-opptak er oppnådd med den samme elektrode, kan den brukes til å registrere signalene over, små celler eller membraner lapper. Teknikken avdekket at ionekanaler ikke er begrenset til hissige membraner av frosk muskler, ål electroplaques, eller blekksprut gigantiske axons ^{3, 4,} men heller at de representerer stedsnærværende inventar av transmembrane signalmekanismer og er iboende i alle mobiltelefontyper membran av uni-eller flercellede organismer, og også til intracellulære membraner. Importantly, evnen til å ta opp transmembrane strømninger ved å feste et glass pipette til en intakt celle gitt enestående mulighet til å registrere aktivitet fra ionekanaler i sine opprinnelige uforstyrret membraner. Således cellen festet patch-clamp teknikk, som er beskrevet i denne protokollen, tillater overvåking av aktiviteten av ionekanaler kontinuerlig i flere titalls min eller lengre i sitt opprinnelige miljø.

Under normale termiske svingninger, alle proteiner, inkludert ionekanal proteiner, gjennomgå strukturelle endringer over en bred tidsskala, med de raskeste og mest hyppige rearrangementer representert mest sannsynlig ved side-kjeden bevegelser og mye langsommere, mindre hyppige endringer representert ved reposisjonering av hele domener eller underenhetene, eller i noen tilfeller via post translasjonsforskning endringer eller protein-protein interaksjoner ^{5, 6.} Observasjon av lange perioder med aktivitet som genereres av et molekyl kan hjelpe til å forstå den funknale dynamikken i ionekanaler i intakte fysiologiske membraner og gir verdifull informasjon om den operative mekanismen av molekylet observert.

I motsetning til den økende forståelse for mangfoldet av ionekanaler tvers celletyper og utviklingsstadier, kunnskap om den molekylære sammensetningen av ionekanaler i innfødte membraner er fortsatt begrenset. Alle ionekanaler er multimere proteiner og de fleste innfødte ionekanaler montere fra flere typer underenheter som produserer proteiner av bred molekylær mangfold, som ofte ledsaget med ulike konduktans og gating egenskaper. Av denne grunn er ionekanaler av definerte molekyl sammensetning undersøkt ved ekspresjon i heterologe systemer. Spesielt HEK293 celler, som er en klonal linje av udødeliggjorte humane embryonale nyreceller ^7, fått bred aksept som den foretrukne system for heterolog ekspresjon av rekombinante ionekanaler. Blant manneny fordeler som forhøyet HEK293 celler som valget system for ionekanal elektrofysiologi er den enkle og kostnader i dyrking og forvalte langvarige stabile kulturer, deres evne til å utføre post-translasjonell folding, foredling og handel av pattedyrproteiner, og i mange tilfeller , deres lave nivå eller fravær av endogen ekspresjon for kanalen i området ^{7, 8.} Uttrykke rekombinante ionekanaler og studere deres funksjonelle egenskaper i HEK293 celler fortsetter å være en verdifull tilnærming for å innhente informasjon om struktur-funksjon egenskaper ionekanaler samt spesifikke egenskaper ionekanal isoformer og deres roller i innfødte vev. De protokoller som er beskrevet i denne artikkelen, kan anvendes like godt for rekombinante ionekanaler uttrykt i HEK293-celler og til å opprinnelige ionekanaler.

I sammendrag, med patch-clamp teknikk, gjennom sin enestående kapasitet løse signals fra ett molekyl er fortsatt, til dags dato, den mest direkte metoden for å observere atferden til enkle molekyler. I sin celle-tilknyttet-modus, tillater patch-clamp-opptak lange observasjonsperioder som, når den gjøres i ett molekyl, kan gi utmerket innsikt i driften av ionekanaler. Nedenfor presenteres en protokoll for å oppnå høy oppløsning løpende opptak fra celle festet patcher som inneholder en ionekanal proteiner.

Protocol

En. Cell Culture and Protein Expression Oppretthold HEK293-celler (ATCC nummer CRL-1573) mellom passasjene 22 og 40, som innbefatter passasjene er utført av ATCC i monolag-kultur i DMEM supplert med 10% kalvefosterserum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin blandingen ved 5% CO2 og 37 ° C. Mellom forsøkene passasje celler i T25-kolber ved 5-20 gangers fortynning i et sluttvolum på 10 ml. Merk: Bruk av celler i løpet av disse passasjene garanterer gunstige celle helse som vil gi rom for optimal…

Representative Results

Rekombinant NMDA reseptorer NMDA reseptorer binde og svare på samtidig handling av to co-agonister: glutamat og glysin. De monterer som heterotetramers av to glycin bindende GluN1 subenheter og to glutamat bindende GluN2 subenheter. GluN2 subenheter er kodet av fire gener (AD) og av disse de mest transkriberte skjemaer i hjernen er GluN2A hos voksne og GluN2B hos unge dyr. På grunn av mangfoldet av NMDA-reseptor-undertyper i native stoffblandinger, som uttrykker reseptorer…

Discussion

I ionekanal-feltet, er et viktig forskningsområde dedikert til å forstå hendelsesforløpet som fører til kanal åpning eller kanalens gating mekanisme. For de fleste kanaler, denne prosessen er kompleks og involverer flere kinetiske fremgangsmåten som ikke kan utledes fra en makroskopisk flerkanalsignal. I motsetning til dette kan være utformet eksperimenter hvor observere sekvensen av åpne / lukkede hendelser enkelt kanal posten kan produsere mer detaljert informasjon om gating mekanismer. I metodene som er besk…

Materials

Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1×51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1