Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

Summary

Descrito aqui é um procedimento para a obtenção de longos trechos de gravação atual de um canal iônico com a técnica de patch-clamp anexado à célula. Este método permite observar, em tempo real, o padrão de open-close conformações dos canais que estão na base do sinal biológico. Estes dados informar sobre as propriedades dos canais nas membranas biológicas não perturbadas.

Abstract

Proteínas de canais iônicos são dispositivos universais para comunicação rápida através das membranas biológicas. A assinatura temporal do fluxo iónico geram depende das propriedades intrínsecas de cada proteína de canal, bem como o mecanismo pelo qual é gerada e controlada e representa uma importante área de pesquisa actual. Informações sobre a dinâmica de funcionamento de proteínas de canais iónicos pode ser obtida observando longas extensões de corrente produzidos por uma única molécula. Descrito aqui é um protocolo para a obtenção de ligado de células de patch-clamp gravações actuais um canal para um canal de iões fechado ligando, o receptor de NMDA, expresso de forma heteróloga em células HEK293 ou nativamente em neurónios corticais. Também são fornecidos instruções sobre como adaptar o método para outros canais de íons de interesse, apresentando o exemplo do canal Piezo1 sensível ao mecano. Este método pode fornecer dados sobre as propriedades de condutância do canal ea seqüência temporal de opeconformações n fechados que compõem mecanismo de ativação do canal, ajudando a compreender as suas funções na saúde e na doença.

Introduction

Comunicação rápida através das membranas biológicas depende quase que exclusivamente em proteínas de membrana oligoméricas poros formando, comumente referido como canais. Estas proteínas são muito diferentes em sinais de ativação, mecanismos de propagação e as propriedades de condutância. Proteínas canal cujo poros são seletivos para os íons são classificados como canais iônicos; sua ativação produz correntes iônicas através da membrana, e suas respostas podem ser gravados com alta resolução em tempo real, usando técnicas eletrofisiológicas. Os sinais de ativação abrangem uma ampla gama de insumos químicos e físicos, incluindo gradientes de concentração, forças mecânicas e elétricas, e temperatura; Assim, a classificação mais canais iônicos em ligante fechado, mechanosensitive, tensão fechado, ou tipos sensíveis ao calor. Neste artigo, os protocolos estão descritos para registar a actividade de um canal de um canal fechado ligando, o receptor de NMDA, e um canal mechanosensitive, Piezo1, usando a técnica de patch-clamp.0;

Patch-clamp electrofisiologia é a primeira e mais largamente utilizado o método experimental suficientemente sensível para permitir a observação de moléculas individuais ^{1, 2.} Além dessa sensibilidade apurada, ele expandiu enormemente as preparações biológicas passíveis de registros eletrofisiológicos e também permitiu a observação de canais iônicos em membranas intactas. Em primeiro lugar, porque, tanto de fixação de tensão e corrente de gravação são realizadas com o mesmo eléctrodo, que pode ser utilizado para gravar sinais através de pequenas células ou membranas de remendos. A técnica revelou que canais iônicos não se restringem a membranas excitáveis ​​dos músculos do sapo, electroplaques enguia, ou axônios gigantes de lula ^{3, 4,} mas sim que eles representam luminárias onipresentes de transmembrana mecanismos de sinalização e são intrínsecos a todos os tipos de membranas celulares de uni ou organismos multicelulares, e também às membranas intracelulares. Importaçãoantly, a capacidade de gravar correntes transmembrana, basta anexar uma pipeta de vidro de uma célula intacta desde que a oportunidade sem precedentes para gravar a atividade de canais iônicos em suas membranas ininterrupto nativas. Assim, a célula ligada técnica de patch-clamp, que é descrito neste protocolo, permite monitorar a atividade dos canais iônicos continuamente por dezenas de minutos ou mais em seu ambiente nativo.

Sob flutuações térmicas normais, todas as proteínas, incluindo proteínas de canais iônicos, são submetidos a mudanças estruturais mais de uma escala de tempo largo, com os rearranjos mais rápidas e mais freqüentes representados provavelmente por movimentos de cadeia lateral e muito mais lentas mudanças, menos freqüentes representados pelo reposicionamento de toda domínios ou sub-unidades, ou em alguns casos por modificações pós translacionais ou interações proteína-proteína ^{5, 6.} Observando longos períodos de atividade geradas por uma molécula pode ajudar a compreender a funçãodinâmicas tradicionais de canais de íons nas membranas fisiológicas intactas e fornece informações valiosas sobre o mecanismo operacional da molécula observado.

Em contraste com a crescente compreensão da diversidade de canais iônicos em todo os tipos de células e estágios de desenvolvimento, o conhecimento sobre a composição molecular de canais iônicos em membranas nativas ainda é limitada. Todos os canais iônicos são proteínas multiméricas ea maioria dos canais iônicos nativas montar a partir de vários tipos de subunidades que produzem proteínas da diversidade molecular de largura, que é muitas vezes acompanhada com diversas condutância e gating propriedades. Por esta razão, os canais de iões da composição molecular definida são estudados por expressão em sistemas heterólogos. Em particular, as células HEK293, que são uma linha clonal de células embrionárias de rim humanas imortalizadas ^7, ganhou aceitação generalizada como o sistema preferido para a expressão heteróloga de canais de iões recombinantes. Entre o homemvantagens y que elevaram células HEK293 como o sistema de escolha para canal iônico eletrofisiologia são a facilidade e acessibilidade de cultivo e manutenção de culturas estáveis ​​de longa duração, a sua capacidade de realizar pós-translacional dobrar, processamento e tráfico de proteínas de mamíferos, e em muitos casos , o seu nível baixo ou até mesmo ausência de expressão endógena para o canal de interesse ^{7, 8.} Expressando os canais de iões recombinantes e estudar as suas propriedades funcionais em células HEK293 que continua a ser uma ferramenta valiosa para obter informações sobre as propriedades de estrutura-função de canais iónicos, assim como das propriedades específicas das isoformas dos canais de iões e os seus papéis no tecido nativo. Os protocolos descritos neste artigo pode ser aplicado igualmente bem para os canais de iões recombinantes expressos em células HEK293 e a canais de iões nativos.

Em resumo, a técnica de patch-clamp, através da sua capacidade sem precedentes para resolver sinals de uma molécula permanece, até hoje, o método mais direto para observar o comportamento de moléculas individuais. Em seu modo conectado à célula, gravação de patch-clamp permite longos períodos de observação que, quando feito por uma molécula, pode proporcionar uma visão excepcional sobre o funcionamento de canais iônicos. Abaixo é apresentado um protocolo para a obtenção de alta resolução a partir de gravações atuais celulares manchas anexo contendo uma proteína de canal iônico.

Protocol

1. Cultura de células e Protein Expression Manter células HEK293 (ATCC número CRL-1573) entre as passagens 22 e 40, que inclui passagens realizadas pela ATCC, em cultura em monocamada em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina a mistura de 5% de CO 2 e 37 ° C. Entre as experiências, as células de passagem em frascos T25 em 5-20 diluições em um volume final de 10 ml. Nota: A utilização de células durante essas passagens garante a saúd…

Representative Results

Recombinante receptores NMDA Receptores NMDA ligar e responder à ação concomitante de dois co-agonistas: glutamato e glicina. Eles montam como heterotetrâmeros de duas subunidades glicina GluN1 e duas subunidades GluN2 ligação do glutamato de ligação. GluN2 subunidades são codificadas por quatro genes (AD) e de estas formas mais amplamente transcritos no cérebro são GluN2A no adulto e GluN2B em animais jovens. Devido à diversidade de subtipos de receptores de NMD…

Discussion

No campo canal iônico, uma importante área de pesquisa é dedicado à compreensão da seqüência de eventos que leva ao canal de abertura ou mecanismo de propagação do canal. Para a maioria dos canais, este processo é complexo e envolve várias etapas cinéticas, que não pode ser deduzida a partir de um sinal multicanal macroscópica. Em contraste, os experimentos podem ser projetados em observar a seqüência de eventos aberto / fechado no registro de canal único pode produzir informações mais detalhadas sobr…

Materials

Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1×51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1